O que é o Sequenciamento CUT&Tag? Um Guia Completo para Iniciantes

Tradicional ChIP-seq depende de etapas complexas, como a reticulação com formaldeído e a fragmentação ultrassónica, que enfrentam gargalos, incluindo grandes requisitos de amostra (milhões de células), longos ciclos experimentais (5-7 dias) e alto ruído de fundo, limitando a sua aplicação em amostras raras (por exemplo, células únicas, tecido de biópsia clínica) e estudos de proteínas de baixa abundância.

CUT&Tag A tecnologia de (Cleavage Under Targets and Tagmentation) revoluciona a investigação do cromatina ao fundir a seleção de anticorpos com a atividade da transposase Tn5—captura diretamente fragmentos de DNA ligados a proteínas-alvo sem ligação cruzada e, simultaneamente, adiciona adaptadores de sequenciação, reduzindo os requisitos de amostra para 1000 células ou até níveis de célula única, e encurtando o ciclo experimental para 1 dia.

Este artigo tem como objetivo analisar sistematicamente os princípios fundamentais, procedimentos experimentais, vantagens técnicas e cenários de aplicação típicos (modificação de histonas, localização de fatores de transcrição) do CUT&Tag para investigadores básicos e clínicos, ajudando os leitores a compreender rapidamente a lógica subjacente e o valor prático desta tecnologia, além de fornecer suporte metodológico para a realização de análises de alta resolução. pesquisa epigenética.

O que é a sequenciação CUT&Tag?

CUT&Tag é uma tecnologia de pesquisa de interação DNA-proteína guiada por anticorpos. Utiliza uma transposase Tn5 engenheirada para clivar precisamente a região do DNA ligada à proteína alvo e adicionar diretamente adaptadores de sequenciação, permitindo a construção rápida de bibliotecas de sequenciação de alto rendimento. O seu princípio fundamental é: usar anticorpos para reconhecer proteínas específicas (como modificadores de histonas ou fatores de transcrição), o complexo da transposase Tn5 que transporta o adaptador de sequenciação é direcionado e ligado à região do DNA alvo. Iões de magnésio ativam a transposase para clivar o DNA e inserir o adaptador, e finalmente, a amplificação por PCR gera a biblioteca de sequenciação.

Comparado com o ChIP-seq tradicional, o CUT&Tag elimina a necessidade de entrelaçamento com formaldeído e fragmentação ultrassónica, encurtando o ciclo experimental para um dia e oferecendo menor ruído de fundo e uma maior relação sinal-ruído.

Anexação in situ para perfilagem de cromatina CUT&Tag (Kaya-Okur HS et al., 2019)

Fluxo de Trabalho da Tecnologia CUT&Tag

1. Processamento de Amostras

• Extração Nuclear: Células vivas ou núcleos são extraídos utilizando esferas magnéticas de ConA, e a permeabilidade da membrana nuclear é aumentada através de um tratamento de permeação com digitonina.

• Incubação de Anticorpos: O anticorpo primário liga-se especificamente à proteína alvo (por exemplo, H3K27me3), e o anticorpo secundário faz a ligação ao complexo de transposase Protein A/G-Tn5.

Reacção de Transposição

• Corte de DNA e Adição de Adaptadores: A enzima Tn5 é ativada em um tampão contendo Mg²⁺ para cortar a região alvo do DNA e inserir adaptadores de sequenciação.

• Purificação de Fragmentos: O fragmento de DNA é purificado por digestão com proteinase K para remover anticorpos e transposases.

3. Construção de Bibliotecas e Sequenciação

• Amplificação por PCR: O fragmento de DNA purificado é amplificado, evitando as etapas de reparação das extremidades e ligação do ChIP-seq tradicional.

• Sequenciação de Alto Débito: A sequenciação em pares é realizada utilizando a plataforma Illumina para obter a informação de sequência da região alvo.

Fluxo de Trabalho de Análise de Dados

1. Controlo de Qualidade e Alinhamento

• Ferramentas de Controlo de Qualidade: O FastQC verifica a qualidade de sequenciação, o MultiQC integra relatórios de múltiplos indicadores.

• Parâmetros de Alinhamento: Utilize o Bowtie2 para alinhar ao genoma de referência, definindo os parâmetros "local" e "muito-sensível" para otimizar a taxa de alinhamento.

2. Chamada de Picos

• Seleção de Ferramentas: MACS2 (parâmetros recomendados: "nomodel", "shift", "75", "extsize", "150") ou SEACR.

• Passos-chave: Distinguir sinais de ligação específicos do ruído de fundo e gerar um arquivo "narrowPeak".

3. Anotação Funcional e Visualização

• Anotação de Genes: Utilize ChIPseeker ou bedtools para associar posições de picos com promotores de genes, exões e outras regiões.

• Ferramentas de Visualização: O IGV exibe a distribuição de picos, e os mapas de calor analisam a força de ligação de regiões específicas (como promotores).

CUT&Tag vs. ChIP-seq: Uma Análise Técnica Comparativa

Aplicações Principais do CUT&Tag

1. Análise de Modificação de Histonas

Detetar modificações de histonas em todo o genoma (por exemplo, H3K27me3, H3K4me1) para revelar mecanismos regulatórios epigenéticos de silenciamento ou ativação de genes.

Estudo de Caso: Shi J et al. utilizaram a tecnologia CUT&Tag para mapear a distribuição genómica em alta resolução de quatro modificações de histonas (H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac, H3K27me3) ao longo de sete estágios de desenvolvimento embrionário (desde o botão germinativo até ao estágio de noz). A análise da dinâmica do estado da cromatina revelou:

• A dinâmica das modificações de histonas (por exemplo, o enriquecimento de H3K4me3 em promotores, a marcação de H3K27ac em potenciadores) foi altamente consistente com a cronologia dos dados do transcriptoma, especialmente durante a ZGA (fase pré-blastocisto), onde a abertura da cromatina e a ativação transcricional estavam sincronizadas (a expressão génica aumentou significativamente durante a fase do blastocisto).

• Isto revelou o mecanismo pelo qual a reprogramação da modificação de histonas (por exemplo, H3K27me3 estabelecido primeiro, seguido pela regulação positiva de H3K4me1/3 mais tarde) e a ativação transcricional impulsionam sinergicamente o desenvolvimento na embriogénese de L. vannamei.

• A tecnologia CUT&Tag revelou pela primeira vez uma paisagem dinâmica de alta resolução das modificações de histonas durante o desenvolvimento embrionário de L. vannamei, revelando o mecanismo regulatório sinérgico entre as transições do estado da cromatina e a expressão génica, identificando genes de desenvolvimento chave e elementos cis-regulatórios, e fornecendo a primeira estrutura epigenética para embriões de crustáceos. epigenómicaregulamentação ZGA e investigação em aquicultura.

Avaliação da qualidade do CUT&Tag na fase de nauplios III (Shi J et al., 2025)

2. Pesquisa sobre Regulação Genómica

Esta pesquisa revela a distribuição e as mudanças dinâmicas de G4 e R-loop no genoma, fornecendo novas perspetivas sobre a estrutura genómica não clássica e a regulação do stress.

Estudo de Caso: Li C et al., utilizando G4-CUT&Tag e R-loop tecnologias CUT&Tag, descoberto:

• Mapeamento do genoma completo dos locais de ligação endógenos de G4: 8195 picos de ligação de G4 foram identificados em células HEK293T (método de auto-biotinilação de G4), com quase 80% localizados em regiões promotoras e o restante em regiões intrónicas/intergénicas; estes picos sobrepuseram-se fortemente aos sinais de G4-CUT&Tag (72%) e foram sensíveis a ligandos de G4 (como TMPyP4).

• O tratamento com Hemin aumenta a formação de G4: 2 horas de tratamento com Hemin aumentaram significativamente a ligação do Hemin aos sinais G4-CUT&Tag em promotores (N=5858) e potenciadores (N=612), indicando que o Hemin promove a formação de estruturas G4 em regiões específicas.

• Os resultados do CUT&Tag de R-loop mostram que o tratamento com Hemina reduz a sinalização de R-loop da ligação da Hemina a promotores e potenciadores (reduzindo a estrutura híbrida de DNA:RNA).

Perfilamento genómico dos locais de ligação da hemina utilizando biotina-PEG4-hemina e reação de auto-biotinilação G4 (Li C et al., 2022)

3. Pesquisa sobre Locais de Ligação de Fatores de Transcrição

Localizar precisamente os locais de ligação do DNA dos fatores de transcrição para elucidar a sua rede regulatória na transcrição génica.

Estudo de Caso: Li Y et al. utilizaram a tecnologia CUT&Tag para analisar as características de ligação da cromatina e os mecanismos regulatórios do LDB1 e dos seus fatores relacionados. As principais conclusões são as seguintes:

• A análise CUT&Tag do LDB1 em seis células T-CEM identificou 26.479 picos de ligação do LDB1:
  • Aproximadamente 40% dos picos estavam localizados em regiões promotoras, e aproximadamente 60% estavam localizados em regiões relacionadas a enhancers (intergénicas ou intrónicas);
  • A análise modal destes picos mostrou que os locais de ligação do LDB1 eram ricos em motivos de fatores de transcrição principais associados à progressão da T-ALL (como ETS1, RUNX1, GATA3 e MYB).
• O circuito regulatório transcricional central construído em amostras de pacientes com T-ALL foi validado usando CUT&Tag (com base em dados de ChIP de H3K27ac);
• A co-localização de LDB1 com IRF1, ERG e ETV6 na cromatina foi observada, e estes fatores exibiram ativação transcricional mútua, indicando que LDB1 é um mantenedor chave do circuito central. A análise CUT & Tag de outras linhas celulares de T-ALL (Loucy, Molt-4, J.gamma1) confirmou que o complexo LDB1 se liga a este potenciador, e que este potenciador é uma região reguladora chave para a transcrição de MYB (a expressão de MYB diminui e a proliferação celular é inibida após a interferência CRISPR).

Distribuição da ligação do LDB1 a regiões genómicas nas 6 células T-CEM, conforme avaliado por CUT&Tag (Li Y et al., 2024)

4. Mecanismos da Doença e Triagem de Medicamentos

Analisando as características de ligação da cromatina de proteínas relacionadas com doenças para explorar alvos terapêuticos.

Exemplo: Zhao H et al., utilizando CUT&Tag-seq (anticorpo H2AZ1), RNA-seqe ATAC-seq técnicas, a relação entre os padrões de deposição de cromatina H2AZ1 e a regulação da expressão génica em células de câncer de pulmão foi revelada. As principais conclusões são as seguintes:

• Os picos de ligação do H2AZ1 estão altamente enriquecidos em torno dos locais de início de transcrição (TSS) (aproximadamente 40% nas regiões promotoras ≤1kb, 60% em regiões relacionadas a potenciadores, como regiões intergénicas/intrónicas); a ligação é menos frequente nas regiões do corpo do gene, e quase não ocorre ligação na "região 0" do TSS (região de ligação da RNA polimerase II/fatores de transcrição).

• A expressão génica é significativamente aumentada apenas quando a H2AZ1 se liga a regiões promotoras ≤1kb ou regiões 5'UTR; a expressão génica é diminuída/silenciada quando se liga a corpos gênicos (promotor 1-3kb, íntrons, exões, etc.) ou não se liga de todo.

• A expressão génica foi significativamente mais elevada quando a deposição de H2AZ1 foi combinada com a abertura da cromatina na região do promotor do que quando apenas H2AZ1 estava ligado ou apenas a cromatina estava aberta. Os dados do TCGA validaram esta relação como conservada em tecido pulmonar normal e em LUAD/LUSC.

• A tecnologia CUT&Tag esclareceu que a deposição de H2AZ1 em torno do TSS (especialmente nas regiões promotoras ≤1kb) é fundamental para a expressão ativa dos genes, e o seu efeito sinérgico com a abertura da cromatina regula a expressão gênica. Também revelou que o H2AZ1 participa em múltiplas vias do câncer e pode regular a expressão gênica de forma bidirecional, fornecendo novas perspetivas sobre os mecanismos epigenéticos do câncer de pulmão.

A ligação da H2AZ1 ao TSS causa uma maior expressão gênica e afeta múltiplas vias de sinalização relacionadas ao câncer, conforme revelado por CUT&Tag-seq e RNA-seq (Zhao H et al., 2024)

Limitações Técnicas e Soluções

• Limitações:
  • Depende de anticorpos de alta qualidade; a ligação não específica pode afetar os resultados.
  • Resolução limitada para fragmentos de DNA muito longos (>1kb).
• Soluções:
  • Priorize anticorpos de grau ChIP validados.
  • Suplementar informações de fragmentos longos combinando com ATAC-seq ou MNase-seq.

Conclusão

O CUT&Tag, com o seu baixo valor inicial, alta sensibilidade e fluxo de trabalho rápido, tornou-se uma ferramenta importante na investigação em epigenética. Seja para modificação de histonas, localização de fatores de transcrição ou análise de mecanismos de doenças, fornece mapas de interação de cromatina de alta resolução. Para iniciantes, recomenda-se começar com o fluxo de trabalho padrão e gradualmente dominar a análise de dados e a interpretação de resultados.

As pessoas também perguntam

O que é sequenciação CUT&Tag?

Sequenciação CUT&Tag combina a clivagem controlada direcionada por anticorpos através de uma fusão de proteína A-Tn5 com sequenciação de DNA em massa para identificar os locais de ligação de proteínas associadas ao DNA. Pode ser utilizado para mapear com precisão os locais de ligação ao DNA global para qualquer proteína de interesse.

Quantas leituras para CUT&Tag?

As bibliotecas devem ser sequenciadas até uma profundidade de 5-8 milhões de leituras totais. Para uma cobertura suficiente, cada biblioteca deve gerar 3-5 milhões de leituras únicas (após a remoção de leituras de mapeamento múltiplo, leituras duplicadas, leituras em regiões da lista de exclusão DAC).

Qual é a diferença entre CUT&RUN e CUT&Tag?

CUT&RUN utiliza Ca²⁺-ativou pAG-MNase para clivar o DNA enquanto o CUT&Tag utiliza Mg²⁺-ativou-se o pAG-Tn5 para clivar o DNA. O Tn5 é carregado com adaptadores Illumina que são adicionados à cromatina durante o processo de clivagem.

Como funciona a tagmentação Tn5?

A Illumina desenvolveu o protocolo de tagmentação, no qual uma enzima Tn5 modificada corta o DNA de cadeia dupla e, simultaneamente, liga as sequências de ligadura que são necessárias para a sequenciação da Illumina a ambas as extremidades.

Qual é a profundidade de sequenciamento do CUT&Tag?

CUT&Tag, a transposase, corta a cromatina apenas em proximidade próxima ao local de ligação da proteína, resultando em comprimentos mais curtos de DNA a serem sequenciados. Isso permite uma profundidade de sequenciamento mais baixa (3-5 milhões de leituras) para gerar dados robustos, com um sinal de fundo mais baixo do que a maioria dos ensaios de ChIP-Seq.

Referências

1. Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, Pledger ES, Bryson TD, Henikoff JG, Ahmad K, Henikoff S. CUT&Tag para perfilagem epigenómica eficiente de pequenas amostras e células únicas. Nat Commun29 de abril de 2019; 10(1):1930.
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