Como Detetar Modificações de Histonas por Sequenciação?

O que são modificações de histonas?

Modificações de histonas são alterações químicas intrincadas que desempenham um papel fundamental na regulação da informação genética armazenada no DNA. No código genético, a sequência das bases nucleotídicas, adenina (A), citosina (C), timina (T) e guanina (G), é fundamental. À volta do DNA, existem quatro proteínas histonas principais - H2A, H2B, H3 e H4 - que, em conjunto, formam uma estrutura semelhante a contas. Esta montagem, conhecida como nucleossoma, serve como o bloco de construção fundamental da cromatina.

Cada nucleossoma é composto por dois conjuntos destes histonas centrais, criando uma estrutura octamérica. A cadeia de ADN envolve este octâmero, abrangendo aproximadamente 145 a 147 pares de bases.

O que distingue os nucleossomas de contas suaves e uniformes são as "caudas" que se estendem das histonas H2A, H2B, H3 e H4. Estas caudas são compostas por sequências específicas de aminoácidos e estão sujeitas a modificações pós-traducionais (PTMs). Estas modificações abrangem uma variedade de alterações químicas, incluindo metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitinação e mais.

Estrutura da histona.

As modificações de histonas exercem uma influência profunda em processos críticos dependentes de DNA, como a compactação dos cromossomas, a dinâmica dos nucleossomas e a regulação da transcrição. Ao afetar o nível de compactação da cromatina e a acessibilidade, essas modificações têm um impacto significativo na expressão génica. Em última análise, desempenham um papel fundamental na modelagem de todos os aspectos da fisiologia biológica e dos processos de desenvolvimento. No âmbito da epigenética, as modificações de histonas estão entre os mecanismos mais importantes para regular a expressão génica em organismos eucarióticos.

Entre estes mecanismos, a acetilação e a metilação de histonas foram objeto de extensa investigação e são reconhecidas como dois processos epigenéticos fundamentais e abrangentes na regulação da expressão génica.

Metilação de Histonas

As modificações de histonas mais minuciosamente examinadas incluem a metilação e a acetilação. As alterações na metilação de histonas são orquestradas por metiltransferases de histonas (HMTs) e desmetilases de histonas (HDMs). Tipicamente, a metilação de histonas ocorre nos resíduos de arginina e lisina de H3 e H4. Esses resíduos podem ser mono-, di- ou trimetilados, com a lisina também a sofrer trimetilação.

A metilação de arginina das histonas aumenta a transcrição, enquanto a metilação de lisina em várias posições produz efeitos diversos, alguns promovendo a expressão génica e outros inibindo-a. A extensão da metilação também confere funções distintas, como a monometilação e a trimetilação da histona H3K4. A H3K4me1 designa tipicamente potenciadores transcricionais, enquanto a H3K4me3 marca promotores de genes.

Metilação de histonas. (Zhou et al., 2011)

Acetilação de Histonas

A acetilação de histonas é regulada por acetiltransferases de histonas (HATs) e desacetilases de histonas (HDACs). Esta modificação ocorre predominantemente em lisinas e estimula a transcrição de transcritos genéticos. O princípio subjacente é que as modificações de acetilação neutralizam a carga positiva das histonas, que são atraídas pelo DNA carregado negativamente. Uma maior acetilação leva a uma redução da ligação entre histonas e DNA, permitindo um acesso mais fácil ao DNA para fatores de transcrição e RNA polimerases. Por exemplo, H3K27ac e H3K9ac estão frequentemente associados à atividade de potenciadores e promotores.

Novas Modificações de Histonas

Além das modificações convencionais de histonas mencionadas anteriormente, numerosas novas modificações surgiram nos últimos anos. Estas incluem lactilação, propionilação, butirilação, 2-hidroxibutirilação, succinilação, malonilação, glutarilação, crotonilação e β-hidroxibutirilação.

Em 2019, a Nature publicou um relatório intitulado "Regulação Metabólica da Expressão Génica pela Lactilação de Histonas", revelando o controlo metabólico da expressão génica através da lactilação de histonas. Este estudo não apenas reintroduziu o conceito de que o lactato é mais do que um mero subproduto metabólico, mas também enfatizou a sua influência nas modificações epigenéticas do corpo. O relatório trouxe a lactilação, uma nova modificação epigenética, para o centro da atenção científica.

Métodos de Investigação de Modificação de Histonas: ChIP-seq

ChIP-seqChIP-seq, um acrónimo para Imunoprecipitação de Cromatina seguida de Sequenciação de Nova Geração (NGS), é uma técnica poderosa na vanguarda da investigação em epigenética. Integra perfeitamente as forças da ChIP, que isola modificações específicas de histonas, com a precisão da sequenciação de segunda geração. Ao empregar anticorpos adaptados a modificações específicas de histonas, este método permite a imunoprecipitação seletiva de fragmentos de DNA modificados por histonas. Subsequentemente, estes fragmentos de DNA são fragmentados e sequenciados, revelando assim as localizações precisas e as abundâncias relativas das modificações de histonas em todo o genoma. O ChIP-seq, de facto, evoluiu para o padrão ouro na elucidação abrangente da distribuição de modificações de histonas no genoma.

As modificações de histonas e a metilação do DNA, como marcas epigenéticas fundamentais, exercem uma influência profunda sobre a arquitetura e a funcionalidade da cromatina. Elas são instrumentais na regulação de uma multitude de processos biológicos essenciais, como a expressão génica, a replicação do DNA e a reparação. A intrincada interação entre esses dois mecanismos epigenéticos é vital para a manutenção do equilíbrio fisiológico e é de importância crítica em vários estados de doença.

Em contraste com metodologias anteriores que necessitavam de abordagens experimentais separadas para a deteção de modificações de histonas e metilação do DNA, tecnologia ChIP-seq, por exemplo, facilita a investigação direcionada de modificações de histonas. Técnicas complementares como BS-seq são utilizados para a deteção precisa de padrões de metilação do DNA. É importante salientar que esta abordagem inovadora não só melhora a eficiência da pesquisa, mas também permite uma análise mais abrangente das marcas epigenéticas. É essencial sublinhar que os métodos tradicionais não só exigem amostras substanciais, mas também carecem da capacidade de avaliar simultaneamente múltiplas marcas epigenéticas.

Sequenciação por Nanoporos

O avanço implacável de Tecnologia de sequenciação por nanopore iniciou uma nova era de investigação em genómica. Notavelmente, os seus comprimentos de leitura alargados e a capacidade de sequenciação direta melhoraram significativamente a precisão da identificação de modificações de histonas. Mais significativamente, a tecnologia de sequenciação por nanoporo tem a capacidade única de discernir simultaneamente a metilação do DNA e as modificações de histonas. Permite explorar a interação inerente entre estes mecanismos epigenéticos enquanto revela simultaneamente a disposição espacial destas marcas ao longo do genoma, mesmo em profundidades de sequenciação baixas.

A sequenciação por nanoporo apresenta vantagens distintas em termos de simplicidade, sensibilidade aumentada e fiabilidade:

• Deteção de Modificações de Histonas e Metilação de DNA: Esta tecnologia inovadora permite a deteção simultânea de modificações de histonas e metilação de DNA numa única molécula de DNA. Ela elimina efetivamente a necessidade de métodos experimentais separados para estudar estes dois marcadores epigenéticos distintos.
• Comprimentos de Leitura Estendidos: Sequenciação por nanoporo fornece comprimentos de leitura alargados, que melhoram substancialmente a precisão e a sensibilidade da deteção, proporcionando uma visão mais abrangente das paisagens epigenéticas.
• Fluxo de Trabalho Simplificado: A metodologia apresenta um procedimento experimental simplificado, condensando todo o processo desde a colheita de células até à preparação da biblioteca em um único dia.
• Exploração de Baixa Cobertura: Notavelmente, a sequenciação por nanoporo permite o perfilamento simultâneo da metilação do DNA e das modificações das histonas, mesmo a baixas profundidades de sequenciação. Isso é fundamental para explorar as conexões intrínsecas entre estes dois elementos epigenéticos críticos.

Referência:

1. Zhou, Vicky W., Alon Goren, e Bradley E. Bernstein. "Mapeando modificações de histonas e a organização funcional dos genomas mamíferos." Nature Reviews Genetics 12.1 (2011): 7-18.