Como Decidir Entre Sequenciamento de Exoma Completo 100X (WES) e Sequenciamento de Genoma Completo 30X (WGS)?

Sequenciamento do Exoma Total (WES)

O Sequenciamento do Exoma Total (WES) é uma tecnologia de ponta que se concentra nas seções exónicas do genoma humano, que representam apenas 1,5% do genoma total. Esses exões são vitais, pois abrigam a maioria das mutações conhecidas que causam doenças. O WES utiliza sondas ou técnicas de sequenciamento de amplicons para direcionar e sequenciar seletivamente o DNA dentro dessas regiões exónicas. Essa precisão permite a identificação de mutações genéticas que desempenham um papel fundamental na função das proteínas. Para garantir resultados robustos, os especialistas recomendam uma profundidade de sequenciamento de pelo menos 100X, equivalente a cerca de 12G de dados.

O WES se destaca por superar as limitações de custo e profundidade associadas ao resequenciamento do genoma completo. Ele oferece uma alta profundidade de sequenciamento, custo-efetividade e a capacidade de examinar diretamente sequências codificadoras de proteínas em busca de variantes que afetam a estrutura da proteína. A capacidade de sequenciamento profundo facilita a identificação de variantes comuns, de baixa frequência e raras. Além disso, o WES direciona exclusivamente as regiões exónicas, reduzindo significativamente os custos, os tempos de resposta e as cargas de trabalho. No entanto, é crucial notar que o WES pode ter limitações na detecção de variações no número de cópias (CNVs) e variantes estruturais (SVs) devido à sua preferência durante o processo de captura e à cobertura limitada de regiões não codificantes.

Vantagens do WES

• Mutações Causadoras de Doenças: Aproximadamente 85% das mutações conhecidas que causam doenças em humanos estão localizadas na região do exão, tornando o WES uma ferramenta poderosa para a exploração de novos genes relacionados a doenças em humanos.
• Rendimento Diagnóstico: O WES apresenta uma taxa de sucesso diagnóstico mais alta para pacientes que são estreitamente relacionados, exibem sintomas graves ou manifestam múltiplos sintomas.
• Anotações Ricas: O WES cobre mais de 85% das mutações causadoras de doenças, incluindo aquelas em regiões não codificantes. Ele também se beneficia de extensas anotações de bancos de dados e literatura, auxiliando os clínicos na interpretação.
• Variantes da Região Codificadora: O WES é proficiente na detecção de Variantes de Significado Incerto (VUS) dentro da região codificadora, o que é crucial para a pesquisa do exoma.

Desvantagens do WES

• Perde Mutações Não Codificantes: Cerca de 10% das mutações conhecidas que causam doenças associadas a doenças humanas estão situadas em regiões não codificantes, podendo escapar à detecção pelo WES.
• Desafios com Regiões Genómicas Únicas: O WES pode enfrentar desafios ao capturar regiões genómicas com alto conteúdo de GC, sequências repetitivas ou pseudogenes.
• Mutações Complexas: Reconhecer tipos específicos de mutações, como variantes complexas do número de cópias e anomalias estruturais, pode ser desafiador usando WES.

Sequenciamento do Genoma Total (WGS)

O Sequenciamento do Genoma Total (WGS) é uma técnica de análise genética de ponta que envolve o sequenciamento meticuloso do genoma completo de um indivíduo. Subsequentemente, esses fragmentos de DNA sequenciados são comparados a um genoma de referência, permitindo discernir variações genéticas. Um dos aspectos mais distintivos do WGS é sua capacidade incomparável de revelar informações das regiões não codificantes do genoma, um fator crucial na decifração das bases genéticas de doenças complexas. Se sua pesquisa se aprofunda em variações genéticas não codificantes e estruturais ou se você possui uma compreensão limitada da patologia das doenças, então o WGS surge como a tecnologia preferida.

Normalmente, o WGS busca alcançar uma profundidade de sequenciamento de pelo menos 30X ou superior, resultando em um volume substancial de dados, frequentemente superior a 90 gigabytes. No entanto, é crucial reconhecer que o WGS também apresenta um conjunto de limitações, abrangendo seu custo elevado, complexidade dos dados e as dificuldades de interpretar variantes de baixa abundância atribuíveis à profundidade de sequenciamento relativamente rasa.

Uma vantagem saliente do WGS é seu escopo abrangente; ele elimina a necessidade de um passo de captura prévio e abrange todo o genoma. Essa metodologia não apenas abrange regiões codificadoras, mas também se estende a domínios não codificantes e regulatórios. Além disso, o WGS se destaca na detecção de variantes estruturais, incluindo translocações balanceadas e inversões.

No entanto, existem várias desvantagens associadas ao WGS

• Desafios em Regiões Altamente Repetitivas ou Homólogas: Distinguir e analisar com precisão regiões do genoma que são densamente repetitivas ou homólogas pode ser desafiador, pois distinguir entre essas regiões pode ser uma tarefa formidável.
• Significado Funcional Incerto de Variantes Recém Descobertas: Quando variantes genéticas novas são descobertas, seu significado funcional pode permanecer envolto em incerteza, necessitando de validação adicional. Isso representa um desafio notável para os clínicos encarregados de interpretar essas descobertas.
• Limitações do Genoma de Referência: A sequência de referência do genoma humano é construída com base em um número limitado de indivíduos, o que pode levar a erros e lacunas potenciais na sequência de referência. Isso, por sua vez, pode resultar em identificações tanto falsas positivas quanto falsas negativas de variantes genéticas.
• Cobertura Incompleta de Regiões com Alto Conteúdo de GC: O WGS pode fornecer cobertura incompleta de regiões genómicas caracterizadas por alto conteúdo de GC, potencialmente afetando a precisão dos dados.
• Baixa Profundidade de Sequenciamento e Precisão Comprometida na Análise de Mutações: A profundidade média de sequenciamento relativamente modesta de 30X no WGS pode diminuir a precisão da análise de mutações, possivelmente resultando em um número substancial de mutações falsas positivas. Essas falsas positivas exigem etapas de validação adicionais, complicando assim o processo de interpretação e confirmação.

Comparando Dados de WES e WGS com Profundidade de Sequenciamento de 75X

Quando avaliamos os dados de WES e WGS com uma cobertura idêntica de 75X para determinar a proporção de variantes conhecidas dentro da amostra que permanecem não detectadas (variantes falsas negativas), os resultados revelam um contraste marcante. Especificamente, a taxa de falsos negativos para o WES é de 2,17%, enquanto o WGS exibe uma taxa de falsos negativos notavelmente mais baixa de apenas 0,022%. Em outras palavras, o WES, com cobertura de 75X, pode ignorar 2 em cada 100 variantes, enquanto o WGS, com a mesma cobertura, pode perder apenas 2 em cada 10.000 variantes. Isso destaca a substancial superioridade do WGS em termos de sensibilidade e valor preditivo positivo.

Em resumo, a distinção entre WES, que requer uma profundidade de sequenciamento maior (100X), em contraste com 30X para WGS, pode não parecer significativa à primeira vista. No entanto, é crucial reconhecer que o WGS se destaca na detecção abrangente de vários tipos de variantes, particularmente aquelas em regiões não codificantes. Consequentemente, a escolha entre WES e WGS deve ser guiada pelas demandas específicas da pesquisa ou diagnóstico, além de considerações relacionadas ao orçamento e ao processamento de dados.

Um estudo realizado em 2018 comparou os méritos do sequenciamento do exoma total e do sequenciamento do genoma total. Esta pesquisa envolveu WES simultâneo utilizando a plataforma ION proton em 70 participantes, alcançando uma profundidade média de sequenciamento superior a 100X. Os resultados demonstraram que 35 desses participantes receberam um diagnóstico molecular definitivo, enquanto o WES não conseguiu identificar mutações causadoras de doenças em nove pacientes, que foram detectadas com sucesso pelo WGS. Esses loci negligenciados incluíram variantes de nucleotídeo único (SNVs) localizadas em intrões profundos, pequenas variações no número de cópias (CNVs), SNVs em regiões não codificantes, variantes mitocondriais e SNVs com baixa cobertura de exão. É importante notar que métodos de captura alternativos podem não enfrentar as mesmas limitações.

Portanto, a seleção entre WES e WGS deve ser baseada nos requisitos específicos do estudo ou diagnóstico, bem como em considerações orçamentárias e de processamento de dados.

Referência:

1. Lionel, Anath C., et al. "Melhoria do rendimento diagnóstico em comparação com painéis de sequenciamento de genes direcionados sugere um papel para o sequenciamento do genoma total como um teste genético de primeira linha." Genetics in Medicine 20.4 (2018): 435-443.