Exploração de Locais CpG através da Tecnologia de Sequenciação

O que é uma ilha CpG?

As ilhas CpG são regiões especializadas dentro do genoma, frequentemente enriquecidas com dinucleotídeos "CG", encontradas notavelmente nas regiões promotoras de muitos genes, especialmente aqueles associados a funções de manutenção celular. Estes locais CpG desempenham um papel crucial na recrutaçã de fatores de transcrição, influenciando a expressão genética. O estado de metilação elevado das ilhas CpG modula ainda mais a recrutaçã de fatores de transcrição, impactando assim a regulação genética. No contexto da metilação do DNA em mamíferos, a metilação do tipo CG prevalece, e os locais CpG, abundantes em dinucleotídeos CpG, estão comumente situados próximos a regiões regulatórias transcricionais. Notavelmente, estas ilhas CpG estão ligadas a aproximadamente 56% dos genes codificadores no genoma humano, sublinhando a importância primordial de estudar o seu estado de metilação no domínio da pesquisa em metilação.

A densidade de CpG, intimamente entrelaçada com a dinâmica da metilação do DNA em vários tecidos, categoriza o genoma em cinco regiões: ilha CpG (CGI), a área dentro de 2kb a jusante da ilha CpG (praia CpG), e a zona dentro de 2kb tanto a montante quanto a jusante da praia da ilha CpG (prateleira CpG). Os níveis de metilação de cada região são meticulosamente avaliados individualmente.

Aplicações da Pesquisa em CpG

• Pesquisa Epigenética: A metilação do DNA desempenha um papel crucial na preservação da função celular normal, manutenção da estrutura dos cromossomas e facilitação da inativação do cromossoma X. Explorar as ilhas CpG contribui para o avanço da pesquisa em epigenética humana.
• Deteçã de Câncer Precoce: Níveis elevados de metilação em promotores de genes são frequentemente observados na transcrição de genes associados a tumores malignos. Este fenômeno é considerado uma característica da transformação maligna celular, permitindo a deteçã precoce do câncer através do sequenciamento de metilação de genes.
• Pesquisa em Desenvolvimento Embrionário: A metilação do DNA desempenha um papel fundamental na impressão genética e no desenvolvimento embrionário. Estudos sobre ilhas CpG oferecem insights valiosos para entender os processos intrincados envolvidos no desenvolvimento embrionário.
• Pesquisa em Células-Tronco e iPSC: As ilhas CpG são instrumentais na análise de padrões de metilação, fornecendo insights sobre os processos de diferenciação de células-tronco e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs).

Sequenciamento de Bisulfito na Pesquisa em CpG

BS-Seq (Sequenciamento de Bisulfito) destaca-se como o método preeminente para a deteçã abrangente de metilação em todo o genoma. Esta técnica envolve a conversão de citosinas não metiladas (C) em uracilo (U) através do tratamento com bisulfito. Ao integrar o sequenciamento de segunda geração e a análise subsequente, BS-Seq permite a deteçã em alta capacidade de locais de metilação.

No processo de tratamento com bisulfito, as citosinas não metiladas são convertidas em uracilo, enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. Os primers de PCR são meticulosamente projetados com base na sequência do local ou região de interesse. Os produtos amplificados são submetidos a vários métodos de deteçã, incluindo eletroforese de PCR, sequenciamento, quantificação por fluorescência e sequenciamento de nova geração (NGS). Os resultados obtidos são então analisados para identificar locais metilados e determinar a frequência de metilação.

Os passos procedimentais do método BSP são descritos da seguinte forma:

• Design de Primers BSP: Projetar primers BSP adaptados à região do gene alvo, normalmente resultando em um produto de amplificação de cerca de 300 pares de bases.
• Tratamento com Bisulfito do Genoma da Amostra: Tratar o DNA genómico com bisulfito para induzir a conversão de citosinas não metiladas em uracilo.
• Amplicação por PCR: Utilizar PCR para amplificar a região de interesse dentro da amostra.
• Clonagem em Vetor: Purificar os produtos de PCR e ligá-los em vetores comumente utilizados.
• Extração de Plasmídeos e Sequenciamento: Extrair e sequenciar plasmídeos de uma seleção de clones positivos, normalmente selecionando 10 para inoculação e cultura. Esta etapa permite a exame detalhado dos padrões de metilação a nível molecular.

Sequenciamento por Nanopore

A plataforma ONT (Oxford Nanopore Technologies) distingue o estado de metilação das bases, como 5mC ou 6mA, analisando as alterações no sinal elétrico à medida que a base atravessa o micropoço do nanopore.

O sequenciamento por nanopore exibe a notável capacidade de identificar diretamente citosinas metiladas, incluindo aquelas em locais CpG, eliminando a necessidade de conversão por bisulfito. Esta tecnologia é particularmente hábil em discernir padrões de metilação em clusters de alta densidade conhecidos como ilhas CpG (CGIs).