Nanopore Direct RNA-Seq: Desvendando a Abundância e Modificações do tRNA

tRNA

tRNAsOs RNAs não codificantes cruciais, abundantes nas células, ocupam uma posição fundamental no intricado processo de tradução de proteínas. Estas moléculas atuam como conectores entre o RNA e os códons de proteínas. Notavelmente, os tRNAs sofrem extensas modificações, com uma média de 13 alterações por molécula de tRNA. Enquanto algumas modificações são estruturais e estáveis, outras exibem características dinâmicas e reversíveis, influenciando significativamente o destino e a função de entidades individuais de tRNA.

As mutações em enzimas modificadoras de tRNA foram associadas a um espectro diversificado de doenças humanas, sublinhando a sua importância na função celular normal. Apesar da sua relevância, existe uma lacuna notável na nossa capacidade de quantificar sistematicamente e com precisão tanto a abundância de tRNAs e suas modificaçõesAtualmente, falta um método simplificado, robusto e eficiente para sequenciar tRNAs, o que dificulta a nossa compreensão abrangente destas moléculas fundamentais e dos seus papéis nos processos celulares.

Nano-tRNAseq

Recentemente, os investigadores introduziram o Nano-tRNAseq, uma revolucionária método baseado em nanoporos desenhado para a sequenciação de tRNAs naturais. Esta abordagem inovadora não só quantifica com precisão a abundância de tRNA, mas também captura modificações, proporcionando uma estrutura robusta para explorar o tRNAome a nível de molécula única.

A nano-tRNAseq pode sequenciar de forma eficiente tanto populações de tRNA IVT como nativas. (Lucas et al., 2023)

Para melhorar a recuperação das leituras de tRNA, os investigadores reprocessaram sistematicamente os sinais de intensidade de corrente bruta de nanopore, resultando num notável aumento de 12 vezes no número de leituras obtidas com sucesso. Esta otimização meticulosa permitiu a reprodução fiel de medições precisas da abundância de tRNA. Subsequentemente, o Nano-tRNAseq foi aplicado para escrutinar a população de tRNA de Saccharomyces cerevisiae, revelando uma complexa interacção e interdependência entre diferentes tipos de modificações de tRNA dentro da mesma molécula. Além disso, o método lançou luz sobre as mudanças dinâmicas na população de tRNA em resposta ao stress oxidativo.

Notável pela sua simplicidade, custo-efetividade, alta capacidade de processamento e reprodutibilidade, o Nano-tRNAseq surge como uma ferramenta poderosa para investigação de modificações de tRNA em vários contextos biológicos. A sua versatilidade torna-a particularmente valiosa para estudar as implicações biológicas das modificações do tRNA em cenários diversos, como o câncer, a exposição ao stress ou infecções virais. Esta descoberta abre possibilidades emocionantes para a utilização de moléculas de tRNA como potenciais biomarcadores para monitorizar a saúde e a doença humanas.

Nano-tRNAseq com MinKNOW Personalizado

Os investigadores utilizaram estrategicamente adaptadores de RNA para povoar tanto as extremidades 5' como 3' das moléculas de tRNA, otimizando a precisão de chamada de bases e mapeamento para capturar sequências completas de tRNA. O Nano-tRNAseq demonstrou um sucesso excecional na utilização da Sequenciação Direta de RNA (DRS) por nanoporo para a sequenciação, chamada de bases e mapeamento abrangentes de moléculas de tRNA, tanto in vitro como naturais.

Ajuste dos parâmetros do MinKNOW aumenta o número de leituras de tRNA sequenciadas e mapeadas. (Lucas et al., 2023)

A utilização de moléculas de tRNA lineares prova ser instrumental na mitigação do entupimento dos poros, melhorando a capacidade de sequenciação, prolongando a integridade do pool de fluxo e estabilizando a taxa de translocação do tRNA através do poro. Isto, por sua vez, refina a precisão do algoritmo de chamada de bases. Notavelmente, os investigadores identificaram que a combinação de 60°C Maxima e SuperScript IV produziu um desempenho ótimo na geração de produtos de cDNA de comprimento total, levando-os a adotar 60°C Maxima para os subsequentes experimentos de sequenciação de tRNA.

A nova metodologia introduzida neste estudo, Nano-tRNAseq, facilita a quantificação precisa e direta da abundância molecular de tRNA natural e do seu estado de modificação utilizando DRS de nanoporo. Os investigadores descobriram que confiar apenas na dupla ligação de adaptadores de RNA era inadequado para generalizar as abundâncias conhecidas de tRNA. Além disso, a configuração padrão do MinKNOW apresentava abundâncias de tRNA enviesadas, favorecendo moléculas de tRNA mais longas. Para enfrentar esses desafios, o estudo implementou uma configuração personalizada do MinKNOW, que não só captura leituras de tRNA de forma mais eficiente, mas também elimina o viés dependente do comprimento, resultando num notável aumento de 12 vezes na capacidade de sequenciação de tRNA.

Referência:

1. Lucas, M.C., Pryszcz, L.P., Medina, R. et al. Análise quantitativa da abundância e modificações de tRNA através da sequenciação de RNA por nanopore. Nat Biotechnol (2023).