Nanopore Direct RNA-Seq: Desvendando a Abundância e Modificações do tRNA

tRNA

tRNAs, RNAs não codificantes cruciais e abundantes nas células, ocupam uma posição central no intricado processo de tradução de proteínas. Estas moléculas atuam como conectores entre o RNA e os códons de proteínas. Notavelmente, os tRNAs sofrem extensas modificações, com uma média de 13 alterações por molécula de tRNA. Enquanto algumas modificações são estruturais e estáveis, outras exibem características dinâmicas e reversíveis, influenciando significativamente o destino e a função de entidades individuais de tRNA.

Mutacões em enzimas modificadoras de tRNA têm sido associadas a um espectro diversificado de doenças humanas, sublinhando a sua importância na função celular normal. Apesar da sua relevância, existe uma lacuna notável na nossa capacidade de quantificar sistematicamente e com precisão tanto a abundância de tRNAs como as suas modificações. Atualmente, falta um método simplificado, robusto e eficiente para sequenciar tRNAs, dificultando a nossa compreensão abrangente destas moléculas centrais e dos seus papéis nos processos celulares.

Nano-tRNAseq

Recentemente, os investigadores introduziram o Nano-tRNAseq, um método baseado em nanoporos revolucionário projetado para a sequenciação de tRNAs naturais. Esta abordagem inovadora não só quantifica com precisão a abundância de tRNA, mas também captura modificações, proporcionando uma estrutura robusta para explorar o tRNAome ao nível de moléculas únicas.

Nano-tRNAseq pode sequenciar eficientemente tanto populações de tRNA IVT como nativas. (Lucas et al., 2023)

Para melhorar a recuperação de leituras de tRNA, os investigadores reprocessaram sistematicamente os sinais de intensidade de corrente bruta do nanoporo, resultando num notável aumento de 12 vezes no número de leituras obtidas com sucesso. Esta otimização meticulosa permitiu a reprodução fiel de medições precisas da abundância de tRNA. Subsequentemente, o Nano-tRNAseq foi aplicado para examinar a população de tRNA de Saccharomyces cerevisiae, revelando interações complexas e interdependência entre diferentes tipos de modificações de tRNA dentro da mesma molécula. Além disso, o método lançou luz sobre mudanças dinâmicas na população de tRNA em resposta ao estresse oxidativo.

Notável pela sua simplicidade, custo-efetividade, alta capacidade de processamento e reprodutibilidade, o Nano-tRNAseq surge como uma ferramenta poderosa para investigar modificações de tRNA em vários contextos biológicos. A sua versatilidade torna-o particularmente valioso para estudar as implicações biológicas das modificações de tRNA em cenários diversos, como câncer, exposição ao estresse ou infecções virais. Esta inovação abre possibilidades empolgantes para utilizar moléculas de tRNA como potenciais biomarcadores para monitorizar a saúde e a doença humanas.

Nano-tRNAseq com MinKNOW Personalizado

Os investigadores empregaram estrategicamente adaptadores de RNA para povoar ambas as extremidades 5' e 3' das moléculas de tRNA, otimizando a precisão de chamada de bases e mapeamento para capturar sequências completas de tRNA. O Nano-tRNAseq demonstrou um sucesso excepcional na utilização da Sequenciação Direta de RNA (DRS) por nanoporo para a sequenciação, chamada de bases e mapeamento abrangente de moléculas de tRNA tanto in vitro como naturais.

Ajuste dos parâmetros do MinKNOW aumenta o número de leituras de tRNA sequenciadas e mapeadas. (Lucas et al., 2023)

Empregar moléculas de tRNA lineares prova ser instrumental na mitigação do entupimento do poro, melhorando a capacidade de sequenciação, prolongando a integridade do pool de fluxo e estabilizando a taxa de translocação de tRNA através do poro. Isso, por sua vez, refina a precisão do algoritmo de chamada de bases. Notavelmente, os investigadores identificaram que a combinação de 60°C Maxima e SuperScript IV produziu desempenho ótimo na geração de produtos de cDNA de comprimento completo, levando-os a adotar 60°C Maxima para os subsequentes experimentos de sequenciação de tRNA.

A nova metodologia introduzida neste estudo, Nano-tRNAseq, facilita a quantificação precisa e direta da abundância molecular de tRNA natural e do seu estado de modificação utilizando DRS por nanoporo. Os investigadores descobriram que confiar apenas na dupla ligação de adaptadores de RNA era inadequado para generalizar as abundâncias conhecidas de tRNA. Além disso, a configuração padrão do MinKNOW exibiu abundâncias de tRNA enviesadas, favorecendo moléculas de tRNA mais longas. Para abordar esses desafios, o estudo implementou uma configuração personalizada do MinKNOW, que não só captura leituras de tRNA de forma mais eficiente, mas também elimina o viés dependente do comprimento, resultando num notável aumento de 12 vezes na capacidade de sequenciação de tRNA.

Referência:

1. Lucas, M.C., Pryszcz, L.P., Medina, R. et al. Análise quantitativa da abundância de tRNA e modificações por sequenciação de RNA por nanoporo. Nat Biotechnol (2023).