Fomentar a Heterogeneidade Tumoral: O Impacto do DNA Extracromossómico Cíclico (ecDNA)

O que é DNA extracromossómico cíclico (ecDNA)?

Desde a década de 1960, a presença de DNA extracromossómico cíclico (ecDNA) tem sido documentada em tumores isolados e células derivadas de tumores. Caracterizado como um corpo de cromatina circular e não filamentoso com comprimentos variáveis que vão de dezenas de quilobases a dezenas de pares de megabases (Mbp), ecDNA cíclico emerge como um fator fundamental que contribui para a heterogeneidade intra-tumoral. A sua envolvência na tumorigénese, evolução tumoral e desenvolvimento de resistência a fármacos sublinha a sua importância.

ecDNA cíclico e Cancro

O ecDNA cíclico desempenha um papel proeminente como uma forma prevalente de amplificação de oncogenes de alta cópia, servindo como um biomarcador prognóstico em vários tipos de tumores. Notavelmente, o meduloblastoma destacou-se nos primeiros relatos de casos que detalham ecDNAInfelizmente, o atual panorama terapêutico para o meduloblastoma carece de terapias moleculares direcionadas altamente eficazes. O padrão de cuidados existente acarreta riscos substanciais, incluindo comprometimento cognitivo, danos neurológicos e a possibilidade de malignidades secundárias.

O meduloblastoma é estratificado em quatro principais subgrupos moleculares: WNT, SHH, tipo 3 e tipo 4. Prognosticamente, os tumores com ativação de MYC no tipo 3 e aqueles com mutações de TP53 nos subtipos SHH apresentam resultados particularmente sombrios. Isso sublinha a necessidade urgente de abordagens terapêuticas inovadoras na gestão do meduloblastoma, dado os desafios associados às modalidades de tratamento atuais e a gravidade do prognóstico dentro de subgrupos moleculares específicos.

ecDNA Agrava o Impacto Oncogénico no Meduloblastoma

Na investigação, foram identificadas 102 instâncias de sequências de DNA extracromossómico (ecDNA) em amostras tumorais obtidas de 82 indivíduos, constituindo 18% dos 468 pacientes estudados. Os tumores com positividade para ecDNA (ecDNA+) foram distribuídos entre os pacientes da seguinte forma: WNT, 0 em 22 no total; SHH, 30 em 112 (27%); tipo 3, 19 em 107 (18%); e tipo 4, 26 em 181 (14%). Notavelmente, os tumores do subgrupo SHH apresentaram uma maior probabilidade de conter ecDNA em comparação com outros subgrupos de meduloblastoma.

Dentro desta coorte, os genes amplificados por ecDNA observados em duas ou mais amostras incluíram oncogenes de meduloblastoma bem estabelecidos ou suspeitos, incluindo MYC, MYCN, MYCL, TERT, GLI2, CCND2, PPM1D (WIP1) e ACVR2B. Além disso, genes associados a mecanismos de reparo do DNA (RAD51AP1 e RAD21) e aqueles que codificam inibidores da via TP53 (PPM1D28 e CDK6) estavam entre os candidatos amplificados por ecDNA identificados. Estas descobertas lançam luz sobre a complexidade paisagem genética do meduloblastoma, enfatizando as potenciais implicações terapêuticas associadas aos oncogenes amplificados por ecDNA nesta malignidade.

A paisagem do ecDNA em tumores de pacientes com meduloblastoma. (Chapman et al., 2023)

ecDNA como Indicador de Prognóstico Adverso em Meduloblastoma

Pacientes com tumores com DNA extracromossómico (ecDNA) exibiram uma sobrevivência global de cinco anos e uma sobrevivência livre de progressão significativamente diminuídas em comparação com aqueles com tumores ecDNA-negativos (ecDNA-). Notavelmente, a sobrevivência global foi consideravelmente mais baixa entre os pacientes com tumores ecDNA+ nos subgrupos SHH, tipo 3 e tipo 4 (P < 0,05). Para avaliar ainda mais a significância prognóstica do ecDNA, foi realizada uma análise de regressão de riscos proporcionais de Cox, revelando que indivíduos com tumores ecDNA+ enfrentaram um risco prognóstico elevado e uma mortalidade aumentada em comparação com seus homólogos com tumores ecDNA- (P < 0,005). Estes achados sublinham o potencial do ecDNA como um marcador prognóstico robusto no meduloblastoma, destacando sua associação com piores resultados clínicos.

Associação de Mutações TP53 com ecDNA em Meduloblastoma SHH

A proteína supressora de tumor p53, codificada pelo TP53, desempenha um papel fundamental na regulação da percepção de danos no DNA, paragem do ciclo celular e apoptose, frequentemente encontrando mutações somáticas e variantes germinativas patogénicas em meduloblastoma SHH. Para explorar a possível ligação entre mutações no TP53 e a presença de ADN extracromossómico (ecDNA), os investigadores analisaram o estado de mutação somática e germinativa do TP53 em 92 casos de meduloblastoma SHH.

Notavelmente, as mutações do TP53 foram mais prevalentes em tumores SHH ecDNA+ em comparação com os seus homólogos SHH ecDNA-. No entanto, esta correlação não foi evidente em outros subtipos de meduloblastoma ou na coorte total, sugerindo uma relação funcional específica do subtipo entre as mutações do TP53 e o ecDNA, particularmente dentro do subtipo SHH. A análise de regressão de Cox revelou que o impacto do ecDNA na sobrevivência não poderia ser atribuído apenas às mutações do TP53. Embora a causalidade não possa ser inferida de forma definitiva apenas a partir destes dados, estas análises destacam as mutações do TP53 e o ecDNA como biomarcadores clinicamente relevantes para tumores de meduloblastoma SHH altamente agressivos.

Coexistência de Perfis ecDNA Diversos em Meduloblastomas Selecionados

A análise de 16 casos de meduloblastoma revelou a presença de múltiplas distintas sequências de DNA extracromossómico (ecDNA)Notavelmente, um tumor de meduloblastoma SHH primário exibindo uma mutação heterozigótica no TP53 (RCMB56-ht) foi selecionado para o estabelecimento de um modelo de xenotransplante ortotópico derivado de paciente em modelo de rato (RCMB56-pdx). Em profundidade sequenciação do genoma completo (WGS) e o mapeamento genómico óptico (OGM) foram utilizados para a montagem do genoma, confirmando a existência de um amplicão circular (amp1) composto por três fragmentos de DNA no cromossoma 1. Além disso, um amplicão de cromatina contínua (amp2) composto por 21 fragmentos nos cromossomas 7 e 17 foi validado.

Para determinar a coocorrência destes distintos perfis de ecDNA nas mesmas células, foi realizada uma imagem de hibridação fluorescente in situ (FISH) multicanal dos mesmos marcadores em células em interfase. A presença de diferentes pontos fluorescentes para cada gene dentro do núcleo da mesma célula indicou que cada cópia do gene amplificado residia em um corpo de cromatina separado. Estas descobertas sublinham a natureza intrincada da diversidade de ecDNA dentro dos meduloblastomas, fornecendo insights valiosos sobre o paisagem genómica complexa desses tumores.

Amplificações extracromossómicas de alta cópia distintas coexistem em um tumor de meduloblastoma SHH. (Chapman et al., 2023)

Heterogeneidade nos Números de Cópias de ecDNA em Meduloblastoma

Nesta investigação, os pesquisadores estabeleceram um pipeline de análise de imagem automatizado para avaliar a distribuição do número de cópias por célula em hibridização in situ por fluorescência (FISH) durante a interfase, com o objetivo de quantificar a heterogeneidade do DNA extracromossómico (ecDNA) em meduloblastoma. A média e a variância dos números de cópias estimados por célula para todos os genes marcadores de amplificação de ecDNA foram significativamente mais altas em comparação com a linha celular de ecDNA COLO320-HSR, que abrange o locus MYC amplificado cromossomicamente. Isso está alinhado com a alta heterogeneidade do número de cópias observada em linhas celulares cancerígenas humanas que apresentam ecDNA.

Notavelmente, em cada tumor primário analisado, apenas 22%-41% das células exibiram um número de cópias amplificado de ecDNA superior a 5. As informações obtidas a partir da microscopia FISH quantitativa e do sequenciamento de célula única multichromossómica indicam que um subconjunto de células dentro dos tumores de meduloblastoma ecDNA+ abriga ecDNAs de alta cópia. Além disso, essas células apresentam números de cópias amplificadas extrachromossómicas únicas ou múltiplas altamente variáveis. Estas descobertas sublinham a natureza intrincada e dinâmica das variações do número de cópias de ecDNA dentro da paisagem celular dos meduloblastomas.

A análise de célula única revela uma população distinta de células tumorais com amplificação de ecDNA em alta cópia. (Chapman et al., 2023)

Perfis Transcriptómicos Únicos em Células ecDNA+

Utilizando o algoritmo de vizinhos mais próximos ponderados para agrupamento, a maioria das células ecDNA+ foi segregada em clusters distintos caracterizados por únicos transcriptómico e perfis epigenéticosNotavelmente, as células dentro do cluster ecDNA+ exibiram uma sobreexpressão significativa dos genes marcadores amp1 e amp2 DNT IP 2 (teste de soma de postos de Wilcoxon, q < 0,001) e KMT2E (q < 0,001). Além disso, GLI2 (q < 0,001) foi notavelmente regulado para cima no cluster de células ecDNA+ em comparação com outras células tumorais e normais. A atividade transcricional dos genes amplificados por ecDNA demonstrou uma correlação positiva com o aumento do número de cópias de ecDNA.

Para contextualizar estas descobertas, os tipos celulares normais foram identificados através da expressão específica de cluster de genes marcadores conhecidos. A estimativa do número de cópias genómicas através de sequenciação de RNA de núcleo único (snRNA-seq) corroborou que as células normais mantinham um genoma estável, em contraste com os clusters de células tumorais que exibiam uma variedade diversificada de alterações no número de cópias. Estes resultados destacam a distinta paisagem molecular das células ecDNA+, enfatizando as suas assinaturas transcripcionais únicas e as alterações genómicas subjacentes em comparação com as células tumorais e normais.

ecDNA Orquestra a Colocação de Oncogenes dentro de uma Paisagem Reguladora de Genes Aberrante

Dadas as profundas rearranjos genómicos associados ao ecDNA do meduloblastoma, o estudo investigou se interacções anómalas de DNA entre oncogenes co-amplificados e potenciadores ocorrem no contexto do ecDNA circular. Para explorar isso, o cromatina acessível de 25 tumores de meduloblastoma foi submetida a análise através de ATAC-seq, enquanto as interacções da cromatina de 17 tumores foram investigadas utilizando captura de conformação da cromatina (Hi-C).

Em metade dos tumores ecDNA+ analisados (D458, MB106, MB268 e RCMB56), foram identificadas evidências convincentes de interações aberrantes de cromatina no ecDNA, abrangendo pontos de quebra estruturalmente variáveis. Essas interações facilitaram a justaposição de motivos acessíveis e genes co-amplificados provenientes de regiões genómicas distais. Os dados de Hi-C revelaram ainda que o promotor do MYC exibiu interações com os cromossomos 8 e elementos regulatórios co-amplificados no cromossomo 14.

Estas descobertas sublinham a prevalência de interações anormais entre potenciadores e promotores resultantes de rearranjos estruturais de ecDNA em tumores de meduloblastoma. O estudo lança luz sobre a intrincada dinâmica regulatória orquestrada pelo ecDNA, fornecendo insights valiosos sobre os fundamentos moleculares da patogénese do meduloblastoma.

As interações da cromatina com o MYC são reconfiguradas em um meduloblastoma do Grupo 3. (Chapman et al., 2023)

Regulação Mediadora de Enhancers da Transcrição de Oncogenes através da Amplificação de ecDNA

Foi realizado um rastreio abrangente de amplificação CRISPRi na linha celular de meduloblastoma tipo 3 D458, utilizando 32.530 sequências de sgRNA que visavam 645 locais acessíveis no DNA extracromossómico (ecDNA). A mesma abordagem de rastreio foi aplicada à linha celular tipo 3 D283, caracterizada pela amplificação de MYC dentro de uma região uniformemente corada de 55 Mbp do cromossoma 8q. Embora o promotor de MYC tenha se mostrado essencial em ambas as linhas celulares, o rastreio identificou seis elementos funcionais que impediam especificamente a proliferação de D458 após 21 dias de inibição CRISPRi.

Descobertas adicionais do rastreio de inibição sublinharam que, embora a amplificação do MYC impulsione a proliferação em todas as linhas celulares de meduloblastoma do tipo 3, a importância relativa dos genes co-amplificados e dos elementos cis-regulatórios variou com base na estrutura genómica do amplificado. Isto destaca a interação subtil entre os oncogenes amplificados e os elementos regulatórios associados, lançando luz sobre o complexo panorama do controlo transcricional dos oncogenes orquestrado pela amplificação de ecDNA no meduloblastoma.

A reprogramação de enhancers em ecDNA de meduloblastoma afeta a proliferação celular. (Chapman et al., 2023)

Referência:

1. Chapman, O.S., Luebeck, J., Sridhar, S. et al. O DNA extracromossómico circular promove a heterogeneidade tumoral no meduloblastoma de alto risco. Nat Genet 55, 2189–2199 (2023).