O que é Sequenciamento de RNA em Lote?

Sequenciação de RNA em massa, comumente conhecido como bulk RNA-seq, fornece informações sobre os níveis médios de expressão gênica dentro de uma amostra de tecido inteira. Esta abordagem é valiosa para transcriptómica comparativa e investigações de biomarcadores. No entanto, carece da capacidade de capturar a heterogeneidade sutil presente nos tecidos.

Fluxo de Trabalho de Sequenciação de RNA em Lote

O RNA-seq em massa, uma técnica fundamental na análise do transcriptoma, tem desfrutado de quase duas décadas de uso generalizado, servindo como uma ferramenta vital para os investigadores. A sua nomenclatura, "em massa", distingue-o do advento subsequente do RNA-seq de célula única. A amplitude de RNA-seq as análises abrangem comparação de sequências, splicing de transcritos, quantificação de expressão, análise diferencial, deteção de genes de fusão, splicing variável, edição de RNA e deteção de mutações.

Considere o processo padrão, exemplificado por plataformas comuns de sequenciação de segunda geração de leituras curtas e longas, como Illumina e SOLiD:

• Construção da Biblioteca de Sequenciamento: Este passo inicial envolve a extração de RNA, a síntese de cDNA e a adição de junções. Para o sequenciamento de mRNA, o Oligo (dT) é frequentemente utilizado para enriquecer o mRNA ou depletar o RNA ribossómico.
• Sequenciação em Plataformas de Alto Rendimento: A biblioteca preparada é submetida a sequenciação numa plataforma de alto rendimento.
• Análise de Dados Upstream: Esta fase abrange o controlo de qualidade, filtragem, comparação (alinhamento/mapeamento), quantificação e análise avançada de variantes de splicing dentro das leituras sequenciadas.
• Análise a Montante: Após a aquisição da matriz de expressão, são empregues diversos métodos para mineração de dados.

Sequenciação de RNA em massa está a abrir caminho para profundas percepções sobre a dinâmica da expressão génica e os processos regulatórios. O fluxo de trabalho de análise de dados inclui:

• Análise de Expressão Diferencial: Esta técnica contrasta genes ou transcritos, identificando diferenças significativas entre vários grupos experimentais.
• Agrupamento e Visualização: As amostras são submetidas a uma análise de agrupamento para elucidar padrões de expressão génica. Métodos como Análise de Rede de Co-expressão Génica Ponderada (WGCNA), agrupamento de coerência, Fatoração de Matriz Não Negativa (NMF) e análise de séries temporais são utilizados.
• Análise de Enriquecimento: Técnicas como Análise de Sobrerrepresentação (ORA), Análise de Enriquecimento de Conjuntos de Genes (GSEA) e Análise de Variação de Conjuntos de Genes (GSVA) revelam vias biológicas enriquecidas.
• Construção de Redes Regulatórias/Interativas: Os investigadores constroem redes intrincadas para elucidar mecanismos regulatórios e interações dentro de sistemas biológicos.

Protocolo abrangente de análise de dados de RNA-seq. (Sahraeian et al., 2017)

scRNA-seq vs. RNA-seq em massa vs. Transcriptómica Espacial

RNA-seq em grande escala é um método convencional para sequenciar RNA em todas as células, agrupando RNA de múltiplas células ou tecidos. Esta abordagem oferece um perfil de expressão geral que representa toda a população celular, facilitando a identificação de genes diferencialmente expressos entre tecidos, condições ou pontos no tempo.

O objetivo principal de RNA-seq em massa é comparar os níveis médios de expressão génica entre diferentes condições ou amostras. Por exemplo, os investigadores utilizam frequentemente esta abordagem para analisar as variações de expressão entre tecidos doentes e saudáveis, identificando genes com alterações significativas na expressão.

No entanto, o Bulk RNA-seq carece da capacidade de discernir disparidades de expressão ao nível de células individuais, podendo obscurecer subpopulações celulares raras, variações transcricionais subtis ou dinâmicas de expressão gênica temporais. Consequentemente, para investigações que necessitam de uma resolução mais fina e exploração da diversidade celular, técnicas mais sofisticadas como o scRNA-seq tornam-se imperativas.

A sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) permite a análise da expressão génica dentro de células individuais, oferecendo insights sobre a heterogeneidade celular além das capacidades dos métodos tradicionais de sequenciação de RNA, como a sequenciação de RNA em massa (Bulk RNA-seq).

Em experiências de scRNA-seq, as células são isoladas individualmente e o seu RNA é extraído. Subsequentemente, o RNA passa por transcrição reversa para cDNA, seguido de amplificação e sequenciação. Esta metodologia de alta resolução facilita a identificação de tipos celulares, estados e subpopulações, revelando a diversidade celular oculta e clusters celulares raros indetectáveis com RNA-seq em massa.

O foco principal da análise de scRNA-seq é explorar a heterogeneidade celular e delinear tipos ou estados celulares distintos. Com o scRNA-seq, são adquiridos dados de expressão génica para cada célula, permitindo uma compreensão mais detalhada das disparidades e diversidade celulares.

Além disso, a scRNA-seq utiliza técnicas de análise de clusters para categorizar células em subgrupos com base nos seus perfis de expressão génica, revelando tanto semelhanças como distinções entre as células. Ao anotar genes marcadores celulares conhecidos, os investigadores podem validar e classificar novos tipos celulares descobertos.

Além disso, a scRNA-seq facilita a identificação de genes expressos especificamente durante várias fases de desenvolvimento, em diferentes tipos de tecidos ou em condições de doença distintas.

Tabela 1 Diferenças entre scRNA-seq, sequenciação de RNA em massa e sequenciação do transcriptoma espacial

Como Escolher a Tecnologia de Sequenciação de RNA Adequada?

A sequenciação de células únicas, a sequenciação de RNA em massa e a sequenciação do transcriptoma espacial oferecem cada uma vantagens únicas e enfrentam limitações específicas. No entanto, a integração das três abordagens pode mitigar as desvantagens individuais, resultando numa análise mais abrangente, precisa e perspicaz dos fenómenos biológicos.

As principais vantagens da análise combinada incluem:

• Perspetiva Abrangente sobre Perfis de Expressão Celular e Organização Espacial: O sequenciamento de células únicas fornece perfis detalhados de expressão génica de células individuais, enquanto o sequenciamento do transcriptoma espacial revela informações sobre a localização espacial dentro dos tecidos. Ao combinar estas abordagens, é possível alcançar uma compreensão mais profunda das funções celulares e interações dentro dos tecidos.
• Qualidade e Fiabilidade de Dados Aprimoradas: Os efeitos de lote e o ruído técnico inerentes ao sequenciamento de células únicas e ao sequenciamento de RNA em massa podem ser identificados e corrigidos através do sequenciamento de transcriptoma espacial. Esta integração ajuda a mitigar potenciais resultados falso-positivos, melhorando assim a fiabilidade geral dos dados.
• Compreensão Holística da Complexidade Biológica: A análise combinada abrange múltiplos níveis, desde as características moleculares de células individuais até o contexto mais amplo de tecidos inteiros. Consequentemente, permite uma interpretação mais abrangente dos fenómenos biológicos intrincados e diversos.

Assim, a adoção da integração destas três metodologias de sequenciação representa uma tendência crucial e uma trajetória de desenvolvimento na investigação biológica.

Caso: Análise de Sequenciamento de RNA em Múltiplas Escalas do Microambiente Tumoral de TNBC e Predição da Resposta a ICI

Objetivo da Pesquisa

O câncer da mama triplo-negativo (CMTN) apresenta uma prevalência notável de defeitos de recombinação homóloga (DRHs), que emergiram como biomarcadores fundamentais que influenciam a resposta a inibidores de pontos de verificação imunológicos (IPVIs). Este estudo teve como objetivo elucidar o impacto dos DRHs no microambiente tumoral (MAT) em múltiplas escalas, aproveitando dados de sequenciação de RNA em célula única, espacial e em massa. Além disso, a investigação procurou construir modelos preditivos para a resposta ao tratamento com base nas características do MAT, utilizando algoritmos de aprendizado de máquina em 11 coortes de tratamento com IPVIs.

Sequenciação de RNA a nível de célula única, espacial e em massa foi recolhida para explorar o papel da HRD no desenvolvimento do TME em múltiplas escalas. (Kang et al., 2023)

Principais Conclusões

• Análise de Célula Única da Influência do HRD: Dados de RNA-seq de célula única de oito amostras de TNBC, compreendendo quatro amostras HRD e quatro amostras não-HRD, foram analisados. A comparação das distribuições dos tipos celulares entre os dois grupos revelou uma maior proporção de células imunes e células estromais no grupo HRD. O aumento observado em linfócitos infiltrantes no grupo HRD sugere uma potencial associação com a expressão aumentada de neoantígenos atribuível aos HRDs.
• Insights de RNA-seq Espacial na Arquitetura do TME: A análise de RNA-seq espacial foi realizada em quatro amostras de TNBC não-HRD para delinear as relações espaciais entre vários tipos celulares. As frações de enriquecimento para cada tipo celular foram derivadas e correlacionadas dentro de cada amostra de RNA-seq espacial. Notavelmente, os miofibroblastos (myCAFs) e os CAFs inflamatórios (iCAFs) exibiram uma exclusividade mútua significativa em uma escala espacial.

Dominância dos myCAFs no TME: Dentro dos loci rotulados como fibroblastos associados ao câncer (CAFs), os myCAFs apresentaram pontuações de enriquecimento significativamente mais altas, consistente com a sua presença predominante no TME de amostras não-HRD.

Validação da Correlação entre DPP4 e myCAFs: Os escores de enriquecimento de myCAFs em loci DPP4+ foram significativamente mais altos do que aqueles em loci DPP4-, corroborando a associação entre a expressão de DPP4 e a abundância de myCAFs em escalas espaciais. Além disso, DPP4 demonstrou uma correlação mais forte com myCAFs em comparação com iCAFs, indicando a sua potencial relevância na modelagem da dinâmica do TME.

Estas descobertas sublinham a intrincada interação entre os HRDs, a composição do TME e a resposta ao tratamento no TNBC. A integração de dados de sequenciação de RNA de célula única, espacial e em massa, juntamente com modelagem preditiva impulsionada por aprendizagem automática, oferece novas perspetivas sobre os fundamentos moleculares da patogénese do TNBC e dos resultados terapêuticos.

Referências:

1. Kang, Kai, et al. "Deficiência de recombinação homóloga no câncer da mama triplo-negativo: A transcriptómica em múltiplas escalas revela microambientes tumorais distintos e limitações na previsão da resposta à imunoterapia." Computadores em Biologia e Medicina 158 (2023): 106836.
2. Sahraeian, Sayed Mohammad Ebrahim, et al. "Obtendo uma compreensão biológica abrangente do transcriptoma através da realização de uma análise de RNA-seq de amplo espectro." Comunicações da Natureza 8.1 (2017): 59.