Diretrizes para Submissão de Amostras
O que são Genes de Resistência a Antibióticos (ARGs)?
Um gene de resistência denota uma sequência de nucleotídeos (fragmento de DNA) responsável por codificar uma característica que confere resistência a medicamentos. Semelhante a outros materiais genéticos, estes genes sofrem replicação durante a divisão e proliferação bacteriana. Estes genes de resistência a antibióticos podem residir no cromossoma bacteriano ou em plasmídeos externos ao cromossoma. Notavelmente, os genes de resistência em plasmídeos podem ser transmitidos entre estirpes da mesma espécie bacteriana ou até entre espécies diferentes através de mecanismos como splicing, transformação e transdução.
Em 2017, a Organização Mundial da Saúde (OMS) identificou 12 "superbactérias" particularmente ameaçadoras, sublinhando a emergência global da resistência bacteriana aos antibióticos como uma preocupação crítica de saúde pública.
Os avanços nas tecnologias de sequenciação e a evolução da bioinformática levaram à adoção generalizada de técnicas de sequenciação de alto rendimento no domínio da deteção de resistência a antibióticos em bactérias. Métodos notáveis incluem sequenciação do genoma completo (WGS), sequenciação metagenómica (mNGS)e sequenciação do transcriptoma de células únicas microbianas, também conhecida como sequenciação de RNA de células únicas microbianas.
Deteção de genes de resistência a antibióticos (ARGs). (Rice et al., 2020)
Os Diferentes Tipos de Genes de Resistência
Os genes de resistência, com base nos antibióticos que induzem resistência, podem ser categorizados em vários tipos. Estes incluem genes de resistência à tetraciclina (tet), genes de resistência a sulfonamidas (sul), genes de resistência a β-lactamases (bla), genes de resistência a macrolídeos (erm), genes de resistência a aminoglicosídeos (aac), genes de resistência a fluoroquinolonas (fca), genes de resistência à colistina (mcr), genes de resistência à vancomicina (van) e genes de resistência a múltiplos fármacos (mdr).
A disseminação global de genes resistentes a medicamentos no ambiente levantou preocupações significativas. Os principais reservatórios de estirpes e genes resistentes a medicamentos são encontrados nos tratos intestinais e fezes de gado e aves, facilitando a transmissão generalizada desses genes. Elementos genéticos móveis (EGMs) desempenham um papel fundamental nesta disseminação, englobando entidades cruciais como sequências de inserção, transposões, integrões, plasmídeos e elementos de splicing integrativos.
A transferência horizontal de genes serve como um mecanismo chave para a transmissão de genes de resistência a medicamentos, ocorrendo através de três processos genéticos comuns:
- Splicing (Mediado por Plasmídeos): Envolvendo a transferência de material genético através de plasmídeos.
- Transformação Natural (Captação de DNA Bacteriano do Ambiente): Onde as bactérias absorvem DNA diretamente do seu entorno.
- Transdução (Mediada por Fagos): Facilitada por bacteriófagos, que atuam como transportadores de material genético entre bactérias.
Compreender estes mecanismos é essencial para enfrentar o desafio da proliferação de genes resistentes a antibióticos e desenvolver estratégias eficazes para mitigar o seu impacto na saúde pública e no ambiente.
Mecanismos de Resistência a Antibióticos
Os genes de resistência a antibióticos (ARGs) que codificam resistência a antibióticos são um fenómeno intrínseco que precede a influência humana. As bactérias exibem resistência através de diversos mecanismos, incluindo a expulsão de antibióticos, a impermeabilidade da membrana celular, a modificação dos alvos dos antibióticos e a síntese de hidrolases de antibióticos. Notavelmente, os aminoglicosídeos, caracterizados por numerosas macromoléculas com grupos hidroxilo e amida expostos, são particularmente suscetíveis à modificação, resultando na manifestação de altos níveis de resistência.
Avanços recentes revelaram novos mecanismos de resistência, incluindo o papel da proteína ABC-F na competição por antibióticos, mutações que incapacitam genes essenciais e o fomento da resistência em condições ambientais desafiadoras. Estas descobertas aprofundam a nossa compreensão do panorama dinâmico e em evolução da resistência a antibióticos, enfatizando a intrincada interação entre as bactérias e a sua resposta a pressões seletivas.
Visão geral dos mecanismos moleculares de resistência a antibióticos. (Darby et al., 2023)
Deteção de Genes de Resistência Bacteriana Baseada em Sequenciação de Alto Débito
WGS é o processo abrangente de decifrar toda a sequência genética de uma determinada espécie. No âmbito da deteção de resistência a medicamentos em bactérias, WGS emerge como uma ferramenta poderosa, oferecendo um perfil detalhado dos genes de resistência a medicamentos dentro das bactérias. Vai além da mera identificação, permitindo a previsão de fenótipos de resistência a medicamentos ao analisar as complexidades dos genes de resistência a medicamentos e desvendar os mecanismos de resistência associados. Vários estudos realizaram comparações entre WGS e AST fenotípico para a deteção de resistência a fármacos bacterianos, demonstrando consistentemente a precisão do WGS na previsão da resistência a fármacos bacterianos.
Além disso, o sequenciamento de genoma completo (WGS) desempenha um papel crucial na elucidação dos genes de resistência a antibióticos presentes tanto em cromossomos como em plasmídeos dentro dos genomas de bactérias resistentes a antibióticos. Este conhecimento contribui significativamente para a compreensão das dinâmicas por trás do movimento e disseminação dos genes de resistência. Adicionalmente, o WGS serve como uma ferramenta valiosa para monitorizar surtos e epidemias de estirpes resistentes a antibióticos. Apesar destas vantagens, é importante notar que o WGS tem certas desvantagens, incluindo um período de teste mais longo, custos mais elevados e a necessidade de culturas bacterianas puras. Estes fatores contribuem para as exigências aumentadas associadas à identificação e isolamento de bactérias clínicas utilizando esta técnica.
Assemblagem versus mapeamento de leitura. (Boolchandani et al., 2019)
mNGS é uma abordagem inovadora projetada para revelar a informação genómica de populações microbianas em amostras ambientais específicas através da tecnologia de sequenciação de alto rendimento. Aproveitando métodos de análise bioinformática, o mNGS facilita a identificação de patógenos, a análise do microbioma, estudos de interação com o hospedeiro e a previsão da resistência a medicamentos bacterianos. No âmbito da deteção de genes de resistência a medicamentos bacterianos em contexto clínico, o mNGS surge como uma ferramenta poderosa capaz de diagnosticar infeções causadas por patógenos desconhecidos e descobrir genes de resistência associados. Esta informação serve como uma referência valiosa para orientar o uso criterioso de antibióticos em ambientes clínicos.
Num estudo notável, Wang et al. utilizaram a tecnologia mNGS para identificar Klebsiella pneumoniae em amostras de tecido pulmonar negativas para cultura de um paciente imunocomprometido com pneumonia severa. A análise revelou ainda genes de resistência como blaSHV-12, blaKPC-2, blaTEM-1, e blaCTX-M-65. Além disso, mNGS prova ser instrumental na deteção de novos genes de resistência, que identificaram 11 genes de resistência a antibióticos previamente desconhecidos a partir de amostras de solo. Estes incluíam novos genes de resistência à ampicilina, genes de resistência à gentamicina, genes de resistência ao cloranfenicol e genes de resistência ao meclobutanil.
Uma vantagem chave do mNGS reside na sua deteção imparcial de genes de resistência a antibióticos diretamente a partir de amostras originais, permitindo a busca por novos genes de resistência a antibióticos juntamente com a triagem dos já existentes. No entanto, é essencial reconhecer que esta tecnologia apresenta desafios inerentes, incluindo altos custos, complexidade e a ausência de um processo de análise padronizado e automatizado. Estes fatores representam obstáculos para a triagem em larga escala de genes de resistência a fármacos bacterianos.
- Sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq)
A sequenciação de RNA de célula única (scRNA-seq) revoluciona a nossa compreensão das populações celulares ao decifrar o transcriptoma de células individuais, desvendando variações populacionais e expondo relações evolutivas. Nos últimos anos, a sequenciação de RNA de célula única em microrganismos emergiu como uma tecnologia avançada, aplicando os princípios do scRNA-seq especificamente em microrganismos, como células bacterianas.
O desenvolvimento do MscRNA-seq enfrenta desafios devido ao baixo conteúdo de mRNA dos microrganismos, às características distintivas da parede celular e da membrana de certas bactérias, e à ausência de poliadenilação do mRNA. Estas barreiras técnicas têm historicamente impedido o progresso do scRNA-seq microbiano. No entanto, a equipa de investigação de Georg Seelig na Universidade de Washington pioneira um avanço ao empregar a sequenciação microSPLiT de transcriptomas de células únicas microbianas utilizando a tecnologia de sequenciação de transcriptomas baseada em ligadura de pool dividido (SPLiT-seq) em bactérias.
O Microbial SPLiT-seq representa um avanço significativo, sendo o primeiro método de sequenciação do transcriptoma de células únicas de bactérias que é rentável e de alto rendimento. O MicroSPLiT, utilizando fontes de RNA rotuladas com código de barras de células bacterianas, pode analisar dezenas de milhares de células bacterianas em um único experimento.
À medida que a tecnologia de scRNA-seq microbiana evolui, ela aborda com sucesso desafios como o baixo conteúdo de mRNA, a diversidade celular e as estruturas complexas da parede celular. A sua aplicação estende-se à exploração do transcriptoma de genes de resistência a medicamentos em superbactérias clínicas. Ao compreender de forma abrangente a expressão e a transferência de genes de resistência a medicamentos, o scRNA-seq microbiano tem uma importância crucial para o avanço da deteção e triagem da resistência a múltiplos medicamentos em contexto clínico.
Resumo
Os métodos tradicionais de deteção de resistência bacteriana oferecem valiosas informações fenotípicas sobre a resistência bacteriana, mas são prejudicados por tempos prolongados de cultura e caracterização, e não conseguem identificar genes de resistência. Tecnologias emergentes baseadas em métodos de biologia física, química e molecular apresentam vantagens como um ciclo de deteção mais curto e uma sensibilidade aumentada na deteção de resistência a medicamentos bacterianos. No entanto, estes métodos enfrentam limitações na deteção de genes de resistência desconhecidos e genes mutados.
O advento de tecnologias de deteção baseadas em sequenciação de alto rendimento serve como uma abordagem complementar, colmatando a lacuna entre a deteção fenotípica clássica e os métodos moleculares. Esta tecnologia avançada destaca-se na identificação precisa de genes de resistência bacteriana, na descoberta de novos genes de resistência e na localização de sítios de mutação. Olhando para o futuro, a integração da deteção fenotípica e genotípica na resistência bacteriana a medicamentos será fundamental para controlar infeções bacterianas resistentes a medicamentos e gerir epidemias. Esta abordagem holística fornece suporte técnico inovador para a prevenção e monitorização de doenças infecciosas relacionadas.
Referências:
- Rice, Eric W., et al. "Determinação de hospedeiros de genes de resistência a antibióticos: uma revisão dos avanços metodológicos." Cartas de Ciência e Tecnologia Ambiental 7.5 (2020): 282-291.
- Boolchandani, Manish, Alaric W. D'Souza, e Gautam Dantas. "Métodos e recursos baseados em sequenciação para estudar a resistência antimicrobiana." Nature Reviews Genetics 20.6 (2019): 356-370.
- Darby, Elizabeth M., et al. "Mecanismos moleculares de resistência a antibióticos revisitados." Nature Reviews Microbiology 21.5 (2023): 280-295.
