Aplicações da Sequenciação de Polissomas em Investigação Biomédica e de Plantas

A regulação precisa da expressão génica é um mecanismo central das atividades vitais, e a eficiência da tradução, como um elo chave na regulação pós-transcricional, afeta diretamente a taxa de síntese de proteínas e a diversidade funcional. A investigação tradicional tem-se concentrado principalmente no nível transcricional, mas explicações sistemáticas sobre questões centrais, como a forma como o mRNA é reconhecido pelos ribossomas e como a taxa de tradução é regulada dinamicamente, continuam a ser escassas. Sequenciação de polissomos (Polysome-seq), ao isolar mRNAs carregados em diferentes ribossomas, conseguiu pela primeira vez a quantificação da atividade translacional a nível de molécula única, proporcionando uma nova perspetiva para revelar mecanismos de doenças, resistência ao stress em culturas e evolução biológica. Nos últimos anos, descobertas inovadoras em áreas como o reprogramação metabólica do cancro e as respostas das plantas ao stress abiótico destacaram o seu valor duplo na investigação básica e em aplicações práticas.

Este artigo revisa sistematicamente os princípios técnicos e casos inovadores do Polysome-seq, com o objetivo de promover a sua aplicação aprofundada em pesquisas interdisciplinares.

Princípios Técnicos e Vantagens

Polysoma-seq, baseado na centrifugação em gradiente de densidade de sacarose, utiliza o alto coeficiente de sedimentação dos ribossomas para separar os mRNAs carregados com diferentes ribossomas: RNA livre, ribossomas únicos (80S) e polirribossomas (mRNAs ligados a múltiplos ribossomas). A análise quantitativa de cada componente através de Sequenciação de RNA permite uma avaliação precisa da eficiência da tradução e a deteção da atividade traducional em regiões não codificantes (como os UTR) e RNAs não clássicos (como lncRNA e circRNA).

Vantagens Técnicas

• "Norma Dourada" para Eficiência de Tradução: Reflete diretamente a atividade de tradução do mRNA, superior a outros métodos indiretos.
• Capacidade de Monitorização Dinâmica: Captura alterações de tradução sob stress, tratamento com fármacos e outras condições, como o aumento da ligação de ribossomas ao mRNA sob stress oxidativo.
• Integração Multi-Dimensional: Pode ser combinada com RNA-seq e epitranscriptómica (como a modificação m7G) para análise conjunta, elucidando redes regulatórias de tradução.

Aplicações em Pesquisa Biomédica

Análise do Mecanismo do Câncer

Chen Y et al., através de perfilagem de polissomasmostrou que nas células MVD KD, o conteúdo de mRNA de GPX4 foi reduzido no grupo de alta multigranulação (grupos 13-19, representando complexos de mRNA-ribossoma ativamente traduzidos), mas o nível total de mRNA não diminuiu.

Este resultado confirma o efeito inibitório da redução de MVD na tradução de GPX4—embora a quantidade total de mRNA de GPX4 tenha permanecido inalterada, a quantidade de mRNA ativamente traduzido (estado ligado a multigrânulos) diminuiu, indicando que o MVD promove a tradução de selenoproteínas (como a GPX4) ao manter as modificações de tRNA (como a modificação de tRNA i⁶A37), enquanto a deficiência de MVD leva à paragem da tradução, fornecendo evidências translacionais para a conclusão subsequente de que "o MVD inibe a ferroptose induzida."

A MVD promoveu a síntese de CoQ10 e a modificação do tRNA de selenocisteína (Chen Y et al., 2025)

Du D et al. utilizaram sequenciação de polissomos, tRNA m⁷G. MeRIP-Seq, e Ribo-seq tecnologias para revelar o mecanismo chave da modificação do tRNA METTL1-m⁷G e da regulação da tradução no BC, proporcionando novos alvos para o tratamento do BC (como inibidores combinados de CDK4/6):

• METTL1 regula a tradução de genes relacionados com o câncer da mama (como GADD45A e RB1) de uma forma dependente do códon.
• Os níveis reduzidos de mRNAs relacionados com polinucleotídeos regulados por METTL1 (como GADD45A e RB1) confirmam o seu efeito de repressão translacional.
• Combinado com Ribo-seq, foi esclarecido que a METTL1 bloqueia seletivamente a tradução durante a fase G2/M do ciclo celular através da modificação do tRNA m⁷G.
• Ao aumentar os níveis de tRNA m⁷G, a tradução de genes-chave como GADD45A e RB1 é promovida, bloqueando a progressão do ciclo celular G2/M e inibindo a proliferação do BC.

METTL1 aumenta os níveis de metilação m7G do tRNA e a tradução global de mRNA (Du D et al., 2024)

Para saber mais sobre as aplicações da sequenciação polirribossomal na investigação do cancro, consulte "Aplicações da Sequenciação de Polissomas na Investigação do Cancro.

(2) Doenças Neurológicas e Metabólicas

Chak K et al., utilizando sequenciação de polissomas, qRT-PCR e técnicas de blotting de Northern, descobriram em conjunto o mecanismo competitivo entre o pre-miR-21 e o miR-21 maduro, revelando a sua base molecular para regular o TGFBR2/NT-3 na epilepsia:

• O pré-miR-21 e o miR-21 maduro competem por locais de ligação no 3'UTR do mRNA TGFBR2 (vantagens de energia sobrepostas), mas não competem pelo mRNA NT-3;
• Após o pré-miR-21 se ligar ao 3'UTR do TGFBR2, ele contrabalança a degradação/inibição da tradução do TGFBR2 pelo miR-21 maduro, levando a um aumento da expressão do TGFBR2 e a uma diminuição da expressão do NT-3 após uma convulsão (SE);
• A análise de sequenciação de polissomos revelou que o pré-miR-21 está localizado no componente multissomal da tradução ativa, sugerindo que pode contrariar a inibição do miR-21 pós-transcricionalmente, prolongando a expressão do receptor TGF-β e afetando a epilepsia.
• A relação entre pre-miR-21 e miR-21 maduro é um fator central que regula a repressão/tradução da degradação de certos mRNAs (como TGFBR2 e E2f6). Um desequilíbrio na relação pre-/maduro pode levar à progressão da doença (como a epilepsia).

O pré-miR-21 está associado a mRNAs envolvidos na tradução ativa (Chak K et al., 2016)

Para saber mais sobre as aplicações da sequenciação polirribossomal na neurociência, consulte "Sequenciação de Polissomas em Neurociência: Perspetivas sobre a Tradução Cerebral.

Li Q et al., utilizando perfilagem de polissomas combinada com análise de estabilidade de RNA, análise de estabilidade de proteínas, e Técnicas RIPdescobriram que o YTHDF1 promove a autofagia induzida por hipoxia e a sua progressão no HCC através da regulação translacional dependente de m⁶A. As suas descobertas são as seguintes:

• Knockout de YTHDF1: o mRNA de ATG2A/ATG14 muda de "multímero (componente de tradução ativo)" para "não multímero", resultando numa diminuição do conteúdo de mRNA no componente de tradução → repressão da tradução;
• A superexpressão de YTHDF1: o mRNA de ATG2A/ATG14 desloca-se para o "multímero", resultando em um aumento do conteúdo de mRNA no componente de tradução → ativação da tradução.
• YTHDF1-WT (tipo selvagem) pode imunoprecipitar mRNA de ATG2A/ATG14, enquanto YTHDF1-MUT (mutação do bolso de ligação m⁶A) não consegue. YTHDF1 liga-se ao mRNA alvo através do bolso de ligação m⁶A.
• YTHDF1 promove a expressão dos genes relacionados com a autofagia ATG2A/ATG14 através da ativação translacional dependente de m⁶A, impulsionando assim a autofagia induzida por hipoxia, o crescimento e a metastização no HCC.

Perfilagem de polissomas de células SMMC7721 e Hep3B hipóxicas (Li Q et al., 2021)

Para saber mais sobre as aplicações da sequenciação polirribossomal em imunologia, consulte "Sequenciação de Polissomas em Imunologia: Regulação Translacional das Respostas Imunes.

Aplicações na pesquisa de plantas

(1) Resposta ao Stress Abiótico

Juntawong P et al., utilizando perfilagem de polissomas combinada com imunopurificação (IP), qRT-PCR e imagem confocal, descobriram a associação entre a proteína de choque frio de Arabidopsis CSP1 (proteína de ligação ao RNA RBP) e ribossomas, bem como a sua regulação translacional seletiva em condições de stress. Os seus resultados foram os seguintes:

• A co-localização do CSP1 com ribossomas: O CSP1-FLAG marcado com epítopo (transgene 35S:AtCSP1-FH#11) estava presente apenas no componente multimérico (complexo de tradução ativa contendo ≥2 ribossomas), e não no monómero de baixa densidade ou na subunidade 40S;
• A tradução global não foi afetada: Os níveis de multi-corpos em plântulas transgénicas eram semelhantes aos do tipo selvagem Col-0, indicando que a superexpressão de CSP1 não altera a síntese geral de proteínas;
• Mudanças sob stress frio: Após o tratamento a 4°C, a abundância e a co-localização multi-corpo de CSP1 aumentaram, mas o nível global multi-corpo não foi afetado (os níveis multi-corpo são insensíveis a temperaturas acima do congelamento).
• CSP1 é um regulador de tradução seletivo que se liga a multiméricos (complexos de mRNA-ribossoma em tradução ativa) e a mRNAs específicos (ricos em G+C na 5'UTR e envolvidos na respiração/ tradução celular). Sob estresse frio ou deficiência de água, a abundância de CSP1 e a colocalização de multiméricos são aumentadas, promovendo a tradução destes mRNAs e, assim, aumentando a resistência das plantas ao estresse. A sua ação é seletiva (não afeta a tradução global) e depende da sua associação com ribossomas.

CSP1 está localizado no núcleo e no citosol, e co-purifica com polissomas (Juntawong P et al., 2013)

Regulação da Maturação da Fruta

A perfis de polissomos foi utilizada para estudar o efeito da knockout de SlYTH2 (proteína de leitura m⁶A de tomate) na eficiência de tradução dos frutos. Os resultados mostraram que:

• A deleção do SlYTH2 (mutante slyth2) não alterou os níveis de subunidades ribossómicas 40S ou 60S, mas o nível de monómeros 80S (ribossomas isolados) diminuiu significativamente.
• A partir do segmento 8 (representando multi-ribossomas, ou seja, complexos de tradução ativos com ≥2 ribossomas), o número de dímeros, trímeros e multiméricos no mutante slyth2 aumentou significativamente.
• O aumento nos picos de multiméricos (complexos de tradução ativos) foi acompanhado por uma diminuição nos monómeros 80S (ribossomas inativos), indicando que a eficiência de tradução dos frutos do mutante slyth2 era superior à do tipo selvagem (WT).
• Tecnologia de perfilagem de polissomos revelou diretamente o papel regulador de SlYTH2 na eficiência da tradução: SlYTH2 reduz a eficiência da tradução de genes-alvo (SlHPL, SlCCD1B) ao inibir a ligação de polissomos multinucleotídicos; após a remoção de SlYTH2, a ligação de polissomos multinucleotídicos dos genes-alvo aumenta, a eficiência da tradução melhora e, em última análise, leva a um aumento de voláteis aromáticos e a um aroma de fruta aprimorado.

SlYTH2 inibe a eficiência de tradução de SlHPL e SlCCD1B, suprimindo assim a acumulação de proteínas (Bian H et al., 2024)

Comparação Técnica e Limitações

Limitações Chave

• Entrada de Amostra Alta: Requer ≥1×10⁷ células, limitando a aplicação para amostras de baixa abundância ou raras.
• Falta de Resolução a Nível de Célula Única: Os protocolos atuais ainda não estão adaptados para a análise de células únicas, dependendo em vez disso da caracterização a nível populacional.

Direções Futuras de Desenvolvimento

• Análise de polirribossomas de célula única: Desenvolvimento de técnicas de processamento de micro-amostras para analisar a heterogeneidade celular.
• Integração multi-ômica: Combinando m6A-seq e Triagem CRISPR para construir redes regulatórias de tradução (como o eixo da autofagia no câncer).
• Tecnologia de rastreamento dinâmico: Utilização de experimentos de séries temporais para revelar mudanças transitórias em eventos de tradução, como a regulação rápida nas respostas ao stress.

Conclusão: O Polysome-seq, ao quantificar a eficiência de tradução e a distribuição de ribossomas, fornece uma ferramenta insubstituível para a investigação dos mecanismos de doenças, melhoria de culturas e adaptação ambiental. Com o avanço da tecnologia de célula única e da integração de multi-ômicas, desempenhará um papel ainda mais importante na medicina de precisão e na biotecnologia agrícola.

Referências

1. Chen Y, Lee D, Kwan KK, Wu M, Wang G, Zhang MS, Deng H, Cheu JW, Lau MH, Chan CY, Ooi ZY, Wu Y, Bao MH, Lo RC, Ng IO, Wong CM, Wong CC. A via mevalonato promove o câncer de fígado ao suprimir a ferroptose através da produção de CoQ10 e da modificação do tRNA de selenocisteína. J Hepatol. 2025 Dez;83(6):1338-1352.
2. Du D, Zhou M, Ju C, Yin J, Wang C, Xu X, Yang Y, Li Y, Cui L, Wang Z, Lei Y, Li H, He F, He J. A metilação do tRNA m7G mediada pelo METTL1 e a disfunção translacional restringem a tumorigenese do câncer de mama ao alimentar o bloqueio do ciclo celular. J Exp Clin Cancer Res31 de maio de 2024; 43(1):154.
3. Chak K, Roy-Chaudhuri B, Kim HK, Kemp KC, Porter BE, Kay MA. O aumento do precursor microRNA-21 após o estado epiléptico pode competir com o microRNA-21 maduro para alterar a tradução. Exp Neurol. Dez 2016;286:137-146.
4. Li Q, Ni Y, Zhang L, Jiang R, Xu J, Yang H, Hu Y, Qiu J, Pu L, Tang J, Wang X. A expressão induzida por HIF-1α do leitor de m6A YTHDF1 impulsiona a autofagia induzida por hipoxia e a malignidade do carcinoma hepatocelular ao promover a tradução de ATG2A e ATG14. Transdução de Sinal e Terapia Alvo. 2021 Fev 23;6(1):76.
5. Juntawong P, Sorenson R, Bailey-Serres J. A proteína de choque térmico 1 acompanha os mRNAs durante a tradução em Arabidopsis thaliana. Planta JJun 2013;74(6):1016-28.
6. Bian H, Song P, Gao Y, Deng Z, Huang C, Yu L, Wang H, Ye B, Cai Z, Pan Y, Wang F, Liu J, Gao X, Chen K, Jia G, Klee HJ, Zhang B. O leitor m6A SlYTH2 regula negativamente o aroma do fruto do tomate ao impedir o processo de tradução. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024 9 de jul;121(28):e2405100121.