Aplicações da Sequenciação CUT&Tag na Epigenética e Regulação Genética

CUT&Tag, com o seu design único de clivagem direcionada e construção de biblioteca in situ, tornou-se rapidamente um novo paradigma em pesquisa em epigenética. Comparado com ChIP-seq, elimina a necessidade de entrelaçamento e sonicação, requerendo apenas uma amostra de célula única para os experimentos, e apresenta uma melhoria na relação sinal-ruído de mais de 50%. Isto fornece uma nova ferramenta para elucidar mecanismos de doenças (como o reprogramação metabólica do câncer) e biologia do desenvolvimento (como a diferenciação de organoides).

Este artigo tem como objetivo rever sistematicamente os princípios técnicos, as principais vantagens e as aplicações de ponta do CUT&Tag e, através de casos típicos na modificação de histonas, regulação de fatores de transcrição e modelos de doenças, elucidar como este método impulsiona a epigenética de "média populacional" para "precisão a nível de célula única."

Princípios Técnicos e Vantagens Principais

CUT&Tag (Cleavage Under Targets and Tagmentation) é uma tecnologia de investigação de interações entre DNA e proteínas guiada por anticorpos. Utiliza uma transposase Tn5 engenheirada para clivar o DNA próximo ao local de ligação da proteína alvo e, simultaneamente, adicionar adaptadores de sequenciação para construir diretamente bibliotecas de sequenciação.

• Os seus passos principais incluem:
  • Ligação de Alvo de Anticorpos: O anticorpo primário reconhece a proteína alvo (como modificadores de histonas ou fatores de transcrição), e o anticorpo secundário amplifica o sinal antes de introduzir o complexo da enzima de fusão Protein A/G-Tn5.
  • Clivagem e Rotulagem Direcionadas: A enzima Tn5 cliva o DNA na região de ligação da proteína alvo e insere adaptadores de sequenciação, libertando DNA fragmentado no espaço extracelular, reduzindo significativamente o ruído de fundo.
  • Construção e Sequenciação de Bibliotecas: Não são necessários passos de entrelaçamento ou sonicação na ChIP-seq tradicional; a preparação da biblioteca pode ser concluída apenas através da amplificação por PCR, com todo o processo finalizado em um dia.
• Vantagens Técnicas:
  • Requisitos de Amostra Baixa: A quantidade inicial de células pode ser tão baixa quanto uma única célula (alguns esquemas otimizados).
  • Alto rácio sinal-ruído: A clivagem direcionada reduz a ligação não específica, resultando em mais de 80% de dados eficazes.
  • Alta resolução: Capaz de detectar locais de ligação finos variando de 200 a 500 pb.
  • Compatibilidade ampla: Aplicável a vários cenários de pesquisa, incluindo modificação de histonas, fatores de transcrição e acessibilidade da cromatina.

Para um guia introdutório detalhado sobre sequenciação CUT&Tag, consulte "O que é a Sequenciação CUT&Tag? Um Guia Completo para Iniciantes".

Reproduzibilidade e eficiência do CUT&Tag (Kaya-Okur HS et al., 2019)

Localização Precisa de Modificações de Histonas

As modificações de histonas (como H3K4me3, H3K27ac e H3K27me3) são um mecanismo central da regulação epigenética, regulando a expressão génica ao alterar a estrutura da cromatina. tecnologia CUT&Tag, através da ligação direcionada por anticorpos e clivagem in-situ, permite a deteção de alta resolução da distribuição de modificações de histonas em todo o genoma, fornecendo "marcadores moleculares" cruciais para elucidar a regulação da expressão génica.

• Desenvolvimento de Organoides: Duong P et al. desenvolveram um protocolo CUT&Tag melhorado para verificar a sua eficácia na análise de modificações da cromatina (usando H3K4me3 como exemplo) durante a regeneração da nadadeira em zebrafish adultos, revelando as mudanças dinâmicas na cromatina relacionada com a regeneração. Em tecido de nadadeira não lesionado, o CUT&Tag detectou quase 48.000 locais de enriquecimento de H3K4me3. Durante o período crítico de regeneração (2 dias após a regeneração), o pico específico da regeneração (motivo FOS) ganhou H3K4me3, enquanto o pico específico de tecido não lesionado (motivo FOX/KLF) perdeu H3K4me3, refletindo a reativação do programa de desenvolvimento embrionário. A acessibilidade da cromatina aumentou nas regiões que ganharam H3K4me3, enquanto a acessibilidade se estabilizou nas que o perderam, regulando sinergicamente a regeneração. Este protocolo confirma a alta eficiência do CUT&Tag em estudos epigenéticos de regeneração, revelando a consistência e as características moleculares da reprogramação de H3K4me3 e da reativação do programa de desenvolvimento na regeneração da nadadeira.

• Modificações de Mapeamento: Zhong Z et al. usaram CUT&Tag tecnologia para mapear a regulação epigenética do genoma em H3K4me3 em células dérmicas (DPCs) de ovelhas de cashmere branco de Shaanbei. Descobriram que a modificação H3K4me3 estava principalmente confinada à proximidade do local de início da transcrição (TSS); a distribuição do pico cromossómico mostrou uma modificação ampla e relativamente uniforme, com a intensidade do sinal ±3 kb no centro do pico exibindo uma distribuição aproximadamente normal. Isto clarificou as características cromossómicas do pico H3K4me3 (como largura do pico, enriquecimento, significância e proximidade ao TSS).

• Identificação de alvos específicos: Janssens, D.H. utilizou CUT&Tag para mapear os alvos específicos de fusão de várias proteínas de fusão KMT2A (como KMT2A–AF9, KMT2A–ENL, etc.), identificando locais comuns e específicos de subtipos tumorais de regulação anormal da cromatina; os locais de ligação da fusão estavam enriquecidos com marcadores de promotores ativos (H3K4me3, RNAP2S5p, H3K27ac) e marcadores genómicos (H3K4me1, H3K36me3), careciam de marcadores de silenciamento (H3K27me3/H3K9me3), e alguns locais apresentavam características bivalentes (H3K4me3+H3K27me3). O CUT&Tag em células únicas mostrou a sua heterogeneidade intercelular (sugerindo plasticidade de linhagem).

Adaptação do CUT&Tag para automação total (Janssens DH et al., 2021)

Uma Análise Detalhada da Regulação dos Fatores de Transcrição

Os fatores de transcrição (TFs) regulam a transcrição gênica ligando-se a regiões promotoras ou de potenciadores de genes, servindo como nós chave na regulação da expressão gênica. A tecnologia CUT&Tag pode identificar locais de ligação de TF com alta resolução e, combinada com ATAC-seq (acessibilidade da cromatina) ou RNA-seq ( expressão génica), revela a rede regulatória de genes mediada por TF.

• Mecanismo de Maturação Folicular: Zhang H, utilizando CUT&Tag, descobriu que biomarcadores significativamente elevados durante a ovulação (como Cyp11a1 e Star) apresentavam uma forte sinalização H3K4me3 nos seus promotores, mas este sinal estava ausente nas regiões de potenciadores ancoradas por H3K27ac, indicando que a ocupação do promotor desempenha um papel central na acessibilidade da cromatina durante a maturação folicular. O CUT&Tag de FoSl2 revelou que o FoSl2 mostrou uma sinalização significativamente aumentada em todo o genoma em pGCs em diferentes estágios de maturação; a média do escore do motivo do pico diferencialmente ocupado era inferior à do pico constitutivo, sugerindo que o aumento da expressão de FoSl2 pode ligar-se a locais de baixa afinidade. O FoSl2 tem uma taxa de ocupação em todo o genoma aumentada, e a sua região de acesso ativada por GC única (GAA) sobrepõe-se ao pico de ganho de FoSl2 em 75% das ovulações. Regula a abertura do GAA e a expressão gênica a montante, mantém o estado da cromatina e é um fator chave na maturação do folículo.

• Distribuição de alvos em todo o genoma de AtSPL9 em Arabidopsis: Tao XY et al. utilizaram os núcleos de brotos com 21 dias para a análise B-CUT&Tag e identificaram 3183 picos, dos quais 60%-70% foram partilhados com os picos das amostras de inflorescência. Comparado com ChIP-seq (ramificações com 14 dias): ChIP-seq produziu 5841 picos (correspondendo a 4744 genes), dos quais 36,1% (1713 genes) e 41,1% (1951 genes) se sobrepuseram aos genes-alvo de inflorescência e brotos na análise B-CUT&Tag, respetivamente, indicando que a regulação de AtSPL9 apresenta variações espaciais (inflorescência vs. broto) e temporais (21 dias vs. 14 dias).

• Dinâmicas da recuperação de GAF na cromatina recém-sintetizada: Wooten M et al. utilizaram o recém-nascido técnica CUT&Tag para analisar a ligação do GAF (um fator de transcrição chave para o desenvolvimento da Drosophila) ao DNA recém-sintetizado. A recuperação geral mostrou que 40% do sinal de GAF no DNA recém-sintetizado foi recuperado rapidamente, enquanto o sinal restante foi recuperado gradualmente ao longo de 4 horas. A análise de heterogeneidade de sítios revelou dois padrões de recuperação diferentes: os sítios de recuperação precoce (265 sítios) mostraram sinal mais baixo, motivos de GAF mais curtos e larguras de pico mais estreitas (largura mediana de 942 bp), enriquecidos com funções relacionadas ao ciclo celular, e foram imediatamente ocupados após a passagem da forquilha de replicação; os sítios de recuperação tardia (157 sítios) mostraram sinal significativo, motivos mais longos e degenerados, e larguras de pico mais largas (largura mediana de 1603 bp), enriquecidos com funções relacionadas ao desenvolvimento, e o seu sinal atingiu o máximo após 4 horas.

• Triagem de genes-alvo a jusante: Gao K et al. analisaram os locais de ligação genómica do fator de transcrição XBP1s utilizando a tecnologia CUT&Tag, identificando um total de 4723 picos de ligação significativos. Descobriram que as características de ligação estavam predominantemente na região do promotor (quase 70% dos picos estavam localizados na região do promotor, e 66,48% dos picos estavam a menos de 1 kb da região do promotor), sugerindo que o XBP1s exerce principalmente o seu papel regulador ligando-se diretamente aos promotores dos genes-alvo. Pesquisas adicionais revelaram que o MAP3K2, um gene chave na via MAPK/ERK, é um gene-alvo direto a jusante do XBP1s. A superexpressão do XBP1s aumentou significativamente os níveis de mRNA e proteína do MAP3K2, enquanto a deleção do XBP1 (KO) inibiu significativamente a sua expressão, esclarecendo o mecanismo regulatório epigenético do eixo XBP1s-MAP3K2-MAPK/ERK na EMT (Transição Epitelial-Mesenquimal) induzida por endometrite.

CUT&Tag o ensaio revela alvos genéticos a jusante de XBP1s (Gao K et al., 2025)

Heterogeneidade epigenética a nível de célula única

A tecnologia CUT&Tag de célula única, com a sua baixa quantidade inicial (100-1000 células) e resolução a nível de célula única, resolve o problema que o sequenciamento em massa tradicional não consegue resolver em relação à heterogeneidade celular, revelando as diferenças epigenéticas entre diferentes subpopulações celulares em tecidos complexos.

• Perfilagem de cromatina multimodal: Bartosovic M et al. desenvolveram a tecnologia nano-CUT&Tag (nano-CT), que utiliza uma proteína de fusão nanobody-Tn5 para localizar simultaneamente três modalidades epigenómicas (acessibilidade da cromatina ATAC, marcador ativo H3K27ac e marcador repressivo H3K27me3) com resolução a nível de célula única. As suas vantagens incluem requisitos baixos de material inicial (25.000-200.000 células), 16 vezes mais contagem de fragmentos por célula em comparação com o CUT&Tag de célula única, e sensibilidade significativamente melhorada. Aplicada à análise de cérebros de ratos jovens, foi encontrado que a deteção multimodal simultânea pode distinguir mais tipos/estados celulares, resolver a velocidade da cromatina da linhagem oligodendrócita e as ondas repressivas H3K27me3, revelando o papel crucial da colaboração multimodal na heterogeneidade celular e na dinâmica de diferenciação.

nano-CUT&Tag (nano-CT) (Bartosovic M et al., 2023)

Otimização Tecnológica e Aplicações de Ponta

Com os avanços tecnológicos, o CUT&Tag tem sido continuamente otimizado, dando origem a novas tecnologias como o CUT&Tag de célula única, o CUT&Tag espacial e o CUT&Tag de leitura longa, expandindo ainda mais os seus limites de aplicação.

• CUT&Tag de célula única: Ao combinar com a plataforma de célula única da 10x Genomics, permite a análise de modificações de histonas ou locais de ligação de fatores de transcrição a nível de célula única, resolvendo o problema que o sequenciamento em massa tradicional não consegue resolver a heterogeneidade celular.

• CUT&Tag Espacial: Ao combinar com a tecnologia de transcriptómica espacial, permite a análise epigenética in situ de tecidos.

• Long-read CUT&Tag: Ao combinar com a tecnologia de sequenciação Nanopore, permite a análise epigenética de longas leituras, resolvendo o problema que a sequenciação de leituras curtas não consegue resolver em regiões genómicas complexas (como sequências repetitivas e variações estruturais).

Conclusão

Sequenciação CUT&Tag tecnologia, como uma ferramenta fundamental em epigenética e a pesquisa sobre regulação genética demonstra um valor insubstituível em múltiplos campos, incluindo a localização de modificações de histonas, regulação de fatores de transcrição, análise de heterogeneidade em células únicas e exploração de mecanismos de doenças, devido às suas vantagens de baixa quantidade inicial, alta relação sinal-ruído e eficiência rápida. Com a contínua otimização da tecnologia (como CUT&Tag de célula única, espacial e de leitura longa), os seus limites de aplicação serão ainda mais expandidos, proporcionando uma ferramenta mais poderosa para a medicina de precisão (como imunoterapia contra tumores e tratamento de doenças metabólicas). No futuro, espera-se que o CUT&Tag seja combinado com mais tecnologias ómicas (como RNA-seq, ATAC-seq e proteómica) para alcançar uma análise de cadeia completa de "epigenética-expressão genética-função celular", oferecendo uma perspectiva mais abrangente para revelar a essência dos fenómenos da vida.

Referências

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