Aplicação da Tecnologia de Sequenciamento RAD

Devido à sua potente capacidade de detetar variações genómicas de forma abrangente, a tecnologia de sequenciação RAD tem utilidade em mais de 20 espécies de animais e plantas que não possuem um genoma de referência. As suas aplicações abrangem o estabelecimento de marcadores genómicos, mapeamento genético e comparativo, mapeamento de alta resolução de genes e QTLs (Locais de Características Quantitativas) associados a traços, investigações em genética populacional e evolução, bem como estudos de associação genómica abrangentes. Além disso, para espécies equipadas com genomas de referência, particularmente aquelas com genomas maiores, a sequenciação RAD confere uma redução substancial nos custos de sequenciação quando comparada à resequenciação de genoma completo. Esta vantagem torna-se particularmente evidente quando tamanhos de amostra substanciais são essenciais para investigações em genética populacional.

Desenvolvimento de Marcadores Moleculares

Em espécies sem um genoma de referência, o processo de obtenção de marcadores moleculares geralmente envolve a busca por polimorfismos utilizando marcadores previamente publicados da mesma espécie ou de espécies estreitamente relacionadas. Alternativamente, a informação de sequência desses marcadores e as sequências de genes conservados de espécies sequenciadas e próximas podem ser aproveitadas para o desenvolvimento de marcadores. Os marcadores gerados utilizando estas abordagens frequentemente consistem em marcadores SSR com polimorfismo limitado, necessitando do design de numerosos primers para produzir um pequeno número de marcadores polimórficos.

Em contraste, a tecnologia de sequenciação RAD oferece vantagens notáveis para o desenvolvimento de marcadores ao permitir a descoberta de numerosos SNPs em todo o genoma através de sequenciação. Quando comparado a Marcadores SSROs SNPs estão densamente distribuídos dentro do genoma. Além disso, a sequenciação RAD é tanto eficiente em termos de tempo como de custo, resultando em reduções significativas nos gastos com mão de obra e recursos.

Mapa genético do trigo com diferentes marcadores

Construção de Mapas Genéticos e Comparativos

Tradicionalmente, o estabelecimento de mapas genéticos de genoma completo utilizando marcadores PCR era um processo caracterizado por aspectos laboriosos, intensivos em recursos e demorados, principalmente devido à necessidade de genotipagem individual de cada marcador em populações segregantes através de eletroforese em PCR. No entanto, a adoção da tecnologia de sequenciamento RAD para os progenitores e suas populações segregantes revolucionou esta prática, permitindo a aquisição rápida de um grande número de genótipos SNP que oferecem uma ampla cobertura de todo o genoma para a construção de mapas genéticos.

Mapas genéticos com maior densidade de marcadores e cobertura oferecem uma gama mais abundante de loci e regiões para análise de genómica comparativa. Consequentemente, esta abordagem facilita uma compreensão mais abrangente e detalhada do genoma e insights em macro nível sobre as relações de colinearidade quando comparadas a espécies estreitamente relacionadas com sequências conhecidas. Notavelmente, este método oferece vantagens distintas para a deteção e caracterização de variações estruturais, como inversões, deleções e translocações.

Mapeamento de Genes/QTL de Traços em Alta Resolução

Os botânicos e os investigadores em melhoramento genético estão muito interessados em decifrar a ligação entre genótipo e fenótipo. Descobrir os genes/QTLs (Locais de Características Quantitativas) que governam características-alvo requer mapeamento genético de alta resolução. Quanto maior a precisão do mapeamento, mais vantajoso se torna não apenas para o subsequente clonagem de genes/QTL, mas também para o melhoramento assistido por marcadores de genes-alvo.

O mapeamento inicial de genes/QTLs necessita de triagem em todo o genoma. Para genes de características qualitativas, a Análise de Segregantes Agrupados (BSA) é comumente utilizada, enquanto o mapeamento preliminar de QTLs requer a varredura do genoma utilizando um mapa genético abrangente. Os mapas genéticos tradicionais construídos com marcadores de PCR variam em densidade de marcadores por todo o genoma. Se um gene-alvo estiver localizado numa região com baixa densidade de marcadores (por exemplo, sem marcadores a uma distância genética de aproximadamente 30 cM), pode ser difícil obter marcadores ligados através da seleção por PCR. A insuficiência de densidade de marcadores afeta igualmente a precisão do mapeamento de QTLs.

Além da precisão do mapeamento, o sequência SNP Os dados derivados da sequenciação RAD são suscetíveis a análises comparativas com as sequências genómicas de espécies estreitamente relacionadas. Em casos onde os SNPs dentro da região mapeada estão situados nas regiões codificantes de genes de interesse, podem ser empregues análises estatísticas para avaliar estas variantes de SNP. Esta análise pode revelar quais genes sofreram substituições não sinónimas ou terminação prematura entre as estirpes parentais. Tais informações fornecem uma referência valiosa para a previsão de genes candidatos e podem agilizar as validações subsequentes da função dos genes.

Análise Genética Populacional e GWAS

A aplicação da tecnologia de sequenciação RAD na análise genética populacional e Estudos de Associação Genómica em Larga Escala (GWAS) envolve principalmente a sequenciação e identificação de variantes em populações naturais da espécie-alvo. Inclui a análise estatística de locais variantes dentro dessas populações, investigando a estrutura populacional e identificando loci no genoma sujeitos a seleção.

Concomitantemente, em combinação com dados fenotípicos, identifica SNPs intimamente associados a características-alvo. A análise conjunta subsequente de loci selecionados e SNPs obtidos a partir de GWAS facilita a exploração da relação entre seleção artificial e evolução populacional.

Referências:

1. Kai W, Nomura K, Fujiwara A, et al. Um mapa genético baseado em ddRAD e a sua integração com a montagem do genoma da enguia japonesa (Anguilla japonica) fornecem insights sobre a evolução do genoma após a duplicação do genoma específica dos teleósteos. BMC Genomics, 2014, 15(1): 233.
2. Kundu A, Chakraborty A, Mandal N A, et al. Um mapa de ligação de DNA associado a locais de restrição (RAD), genómica comparativa e identificação de QTL para o conteúdo de fibra histológica coincidente com aqueles para o rendimento de fibra de bagaço em processo de decorticação e seus principais componentes em juta (Corchorus olitorius L., Malvaceae). Criação molecular, 2015, 35(1): 19.
3. Manousaki T, Tsakogiannis A, Taggart J B, et al. Explorando um genoma de teleósteo não modelo através de sequenciação RAD—mapeamento de ligação na Pandora Comum, Pagellus erythrinus e análise genómica comparativa. G3: Genes, genomas, genética, 2016, 6(3): 509-519.
4. Nadeau NJ, Martin SH, Kozak KM, et al. Padrões genómicos de divergência e fluxo génico numa radiação de borboletas. Mol. Ecol.., 2013, 22: 814–826.