Uma Exploração Abrangente de Métodos para Analisar Locais de Integração

Terapia Génica e Celular

Em 1990, W.F. Anderson, um pioneiro cientista médico americano, alcançou um feito inovador no campo da terapia genética. O seu trabalho transformador envolveu a aplicação de terapia genética a uma menina de 4 anos que lutava contra a deficiência de adenosina desaminase, marcando um momento histórico como o primeiro triunfo mundial em terapia genética e um marco crucial na história da medicina. Nas décadas seguintes de desenvolvimento incessante, a terapia genética emergiu como um farol de esperança, oferecendo uma mudança de paradigma na abordagem ao tratamento de doenças, abordando-as nas suas raízes genéticas.

Categoricamente, a terapia genética desenrola-se em dois modos distintos de tratamento. A terapia in vivo implica a injeção direta de vetores que transportam os genes necessários na corrente sanguínea ou em órgãos-alvo específicos. Este método encontra aplicação nos domínios das doenças genéticas monogénicas, hemofilia e condições oftalmológicas. Por outro lado, a terapia in vitro, reconhecida como terapia celular, envolve a extração das células de um paciente, modificação genética fora do corpo e subsequente reintrodução no sistema do paciente. Uma manifestação notável da terapia in vitro é a terapia com células T com Receptor de Antígeno Quimérico (CAR-T), uma abordagem de precisão inovadora que anuncia uma nova era no tratamento de tumores.

A trajetória do progresso é evidente na aprovação de mais de 20 medicamentos de terapia genética e 8 produtos CAR-T por agências reguladoras de medicamentos nacionais. Armados com biotecnologia sofisticada e promissoras vias terapêuticas, os medicamentos de terapia genética e celular estão prontos para desempenhar um papel fundamental no futuro da prevenção e tratamento de doenças.

Serviço de análise de locais de integração lentiviral da CD Genomics utiliza o poder da Plataforma Illumina para a deteção de locais de integração e desenvolveu uma abordagem de baixo custo e alta capacidade através da sequenciação por enriquecimento de alvos ou método LM-PCR. Temos o prazer de utilizar a nossa vasta experiência e plataforma avançada para oferecer o melhor serviço e os produtos mais qualificados para satisfazer cada demanda dos nossos clientes.

Fluxo de trabalho de análise de site de integração – CD Genomics

Integração Lentiviral na Terapia Génica e Celular

No âmbito da terapia genética e celular, o modo e a eficácia da entrega de genes desempenham um papel crucial na determinação do impacto terapêutico do medicamento. Consequentemente, a seleção de um vetor apropriado assume uma importância primordial. Os sistemas lentivirais têm sido amplamente utilizados em diversas aplicações terapêuticas devido ao seu amplo espectro de infectividade, à capacidade de infetar tanto células em divisão como células não divididas, e à expressão sustentada e estável de genes exógenos a longo prazo.

Integração viral constitui uma faceta crucial do ciclo de vida padrão dos lentivírus. O processo começa com o vírus a reconhecer um recetor na superfície da célula hospedeira, facilitando a transferência de RNA e proteínas para dentro da célula. Após isto, o RNA sofre transcrição reversa para DNA, e a integrase reconhece a Repetição Terminal Longa (LTR) transportada pelo DNA viral. Em seguida, ela corta o genoma do hospedeiro de forma aleatória ou semi-aleatória, resultando em extremidades adesivas que se fundem perfeitamente com o DNA viral, completando a inserção do gene exógeno. A integração viral surge como um passo indispensável para a expressão de genes exógenos e a concretização dos efeitos terapêuticos da terapia genética.

Métodos para Analisar Locais de Integração

• Tecnologia de PCR

Originalmente, a análise de integrações virais envolvia o Southern blot e bibliotecas genómicas para caracterizar os locais de integração. Com o tempo, a PCR substituiu o Southern blot como o principal método analítico para integrações virais devido à sua simplicidade operacional e precisão dos resultados. Dentro do âmbito da tecnologia PCR, surgiram três categorias principais para a análise de integrações virais: PCR reversa (R-PCR), PCR Mediada por Ligação (LM-PCR)e PCR mediada por amplificação linear (LAM-PCR).

Na PCR reversa, o DNA é clivado enzimaticamente e, em seguida, ligado em um laço. Primers reversos são projetados para amplificação, permitindo a recuperação de sequências desconhecidas em ambos os lados do local de integração viral. No entanto, a eficiência limitada da formação do laço pela ligase restringe a utilidade da PCR reversa.

A LM-PCR envolve a ligação das duas extremidades do DNA após a clivagem e interrupção, com primers desenhados com base em sequências fixas do DNA viral e das junções. Esta abordagem desbloqueia a informação posicional do local de integração viral. A LM-PCR é conhecida pela sua simplicidade e facilidade de operação, permanecendo em uso desde a sua criação até aos dias de hoje.

LAM-PCR representa uma técnica mais avançada onde o DNA é inicialmente amplificado de forma linear, e o produto de cadeia simples obtido a partir desta amplificação é posteriormente amplificado por LM-PCR para gerar o produto específico da amplificação de cadeia simples. A introdução da amplificação linear aumenta a sensibilidade e especificidade do LAM-PCR, superando a do Reverse PCR e LM-PCR, tornando-se um método amplamente adotado na pesquisa atual.

Esquema do LAM-PCR para amplificar sequências de fusão genómica de vetores retrovirais 5'-LTR. (Schmidt et al., 2007)

• Sequenciação de Nova Geração (NGS)

A tecnologia de PCR tradicional, que depende da digestão por endonucleases de restrição para a análise de locais de integração, tem preferências inerentes. Simultaneamente, a eletroforese ou o sequenciamento de primeira geração, utilizados no passado, sofrem de baixa sensibilidade e uma capacidade limitada para analisar clones. O cenário mudou em 2005 com a introdução do primeiro sequenciador de alto rendimento, Roche 454, marcando a ascensão de sequenciação de próxima geração (NGS) como a tecnologia predominante para análise integrativa de locais. O NGS, devido aos seus dados de sequenciação abundantes, amplia significativamente o espectro de locais de integração. Notavelmente, destaca-se na deteção de clones de integração de baixa frequência, fornecendo informações inestimáveis para o desenvolvimento de medicamentos.

O processo de construção de bibliotecas de sequenciação de alto rendimento é mais intricado em comparação com a PCR tradicional. Os métodos de construção de bibliotecas comumente utilizados incluem LM-PCR, LAM-PCR e LAM-PCR sem digestão enzimática de restrição. Enquanto a construção de bibliotecas LAM-PCR envolve as complexidades e os altos custos associados a primers marcados com biotina e esferas magnéticas marcadas com estreptavidina na amplificação linear, a LM-PCR surge como uma alternativa prática. A LM-PCR facilita o enriquecimento de sequências de locais de inserção através de um processo de PCR em duas etapas, permitindo a construção da biblioteca em 6-7 horas. Esta abordagem simplificada acelera o ciclo de construção da biblioteca, tornando-a um método ideal para a deteção de locais de inserção lentiviral.

Os lentivírus possuem sequências terminais longas (5'LTR e 3'LTR) em cada extremidade, e a LM-PCR pode amplificar ambos os LTRs para formar bibliotecas. No entanto, nos métodos convencionais de construção de bibliotecas, metade das leituras de dados a montante torna-se informação redundante sobre a integração dos LTRs com as sequências provirais. Assim, a adaptação da LM-PCR destaca-se como uma escolha eficiente e ideal para a deteção do local de inserção do lentivírus.

Referência:

1. Schmidt, M., Schwarzwaelder, K., Bartholomae, C. et al. Análise de sítios de inserção em alta resolução por PCR mediada por amplificação linear (LAM-PCR). Métodos Nat 4, 1051–1057 (2007).