Um Guia para o Sequenciamento do Exoma Total em Câncer

Sequenciação do Exoma Completo (WES) emergiu como uma força transformadora, permitindo a análise abrangente das regiões codificantes dos genes ligados a doenças e à evolução populacional. Quando combinada com os vastos dados de exoma disponíveis em bases de dados públicas, a WES torna-se uma ferramenta poderosa para desvendar as complexas relações entre variantes genéticas, doenças e os mecanismos subjacentes. Embora as suas aplicações sejam diversas, a aplicação da WES na pesquisa do câncer brilha mais intensamente devido à sua complexidade e às oportunidades sem precedentes que oferece para enfrentar um dos inimigos mais desafiadores da humanidade.

Do tecido aos dados—etapas da sequenciação do exoma completo. (Bartha et al., 2020)

Requisitos de Amostra e Extração de DNA: Fundamentos de uma Análise Precisa

A realização da Sequenciação do Exoma Completo em Câncer (CWES) exige uma seleção meticulosa de amostras e extração de DNA para garantir a fidelidade e relevância dos resultados. Os tecidos tumorais, amostras fixadas em formol e embebidas em parafina (FFPE) e sangue periférico são os tipos de amostras comuns utilizados. No entanto, um aspecto crucial da CWES é o emparelhamento de amostras tumorais com amostras normais correspondentes. Este emparelhamento não só mitiga o impacto do background genético, mas também permite a identificação de mutações somáticas únicas do tumor.

O processo de extração de DNA é uma arte delicada destinada a preservar a integridade do DNA enquanto elimina contaminantes. Envolve uma série de etapas, como lise celular, tratamento enzimático, separação de ácidos nucleicos e purificação. Notavelmente, os desafios impostos pelas amostras FFPE exigem atenção especial. A ligação cruzada induzida por formaldeído, a formação de adutos de DNA e modificações que levam a falsos positivos sublinham a necessidade de uma abordagem estratégica no manuseio de tais amostras.

Dominando a Construção de Bibliotecas: Nuances Técnicas

A construção de bibliotecas na CWES é um empreendimento multidimensional onde a precisão é primordial. Vários aspectos técnicos devem ser meticulosamente abordados para garantir resultados de sequenciação precisos e confiáveis.

• Otimização da Eficiência de Transformação de Fragmentos
  O sucesso da construção de bibliotecas depende de alcançar uma alta eficiência de transformação de fragmentos—convertendo o máximo número de fragmentos de DNA iniciais em fragmentos de biblioteca mensuráveis. Um determinante chave do sucesso é a complexidade da biblioteca, que se traduz em uma cobertura de dados de sequenciação mais rica das regiões-alvo. Alcançar isso requer uma consideração meticulosa da quantidade, qualidade e eficiência de conversão dos fragmentos de DNA iniciais. Testes rigorosos e avaliações são indispensáveis para realizar uma eficiência ótima de transformação de fragmentos.
• Controlando o Ruído de Fundo
  Na dança intrincada da Sequenciação de Próxima Geração (NGS), erros surgem e o ruído de fundo confunde o sinal. O ruído de fundo surge de várias fontes, incluindo erros de PCR, imprecisões de sequenciação e regiões genômicas complexas. Abordar isso requer engenhosidade—etiquetas moleculares únicas anexadas a fragmentos de DNA durante a construção da biblioteca atuam como sentinelas, ajudando a discernir mutações reais de sinais errôneos. Esta estratégia inteligente efetivamente reduz o ruído de fundo, elevando a precisão da detecção de mutações.
• Desafiando a Contaminação
  O espectro da contaminação cruzada de amostras assombra a construção de bibliotecas, representando uma grave ameaça à veracidade dos resultados. Rótulos mal colocados ou cruzamentos de dados durante a análise podem distorcer as descobertas. Para impedir isso, o emprego de indexação de dupla extremidade durante a construção da biblioteca torna-se imperativo. Particularmente relevante em plataformas como a Illumina, onde pode ocorrer "index hopping", esta abordagem protege contra a contaminação cruzada de amostras e mantém a integridade dos resultados.
• Neutralizando o Viés de Amplificação
  As regiões genômicas devem ser igualmente representadas no conjunto de dados de sequenciação final para evitar amplificação preferencial e percepções distorcidas. Alcançar esse equilíbrio exige a seleção de uma enzima de alta fidelidade e a calibração cuidadosa dos ciclos de amplificação de PCR. Ao minimizar o viés de amplificação, uma representação mais precisa das variantes genéticas emerge.

Análise de Dados: Desvendando o Tecido Genético

A fase de análise de dados é onde o verdadeiro poder da CWES é aproveitado. Envolve decifrar as complexas alterações genômicas que impulsionam a progressão do câncer e identificar potenciais alvos terapêuticos.

• Priorização de Variantes
  Classificar a vasta gama de variantes requer uma priorização estratégica. As variantes são classificadas com base em seu impacto funcional, frequência em bases de dados e relevância para a biologia do câncer. Variantes patogénicas e provavelmente patogénicas têm prioridade como potenciais mutações driver.
• Anotação Funcional e Análise de Vias
  As ferramentas de anotação funcional desvendam as potenciais consequências das variantes identificadas. Prever seu impacto na estrutura e função da proteína ajuda a avaliar seu papel na carcinogénese. A análise de vias contextualiza essas variantes, destacando vias de sinalização alteradas cruciais para o desenvolvimento do câncer.
• Integração com Dados Clínicos
  Casar insights genômicos com dados clínicos cria um perfil abrangente do paciente. O histórico do paciente, a resposta ao tratamento e os dados de resultado orientam a identificação de mutações acionáveis e potenciais estratégias de tratamento. Esta integração estabelece a base para a oncologia de precisão, adaptando terapias ao panorama genético único de um paciente.

Referência:

1. Bartha, Áron e Balázs Győrffy. "Algoritmos de Análise de Dados de Sequenciação do Exoma Completo em Diagnósticos de Câncer." (2020).