Diretrizes para Submissão de Amostras
Sequenciação de Nova Geração para COVID-19
O que é a COVID-19?
COVID-19, designado formalmente como Doença do Coronavírus 2019, é uma doença respiratória excecionalmente infecciosa provocada pelo coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2). Este vírus é um membro da família Coronaviridae, um grupo que inclui várias estirpes com a capacidade de infectar tanto humanos como animais. A erupção inicial de COVID-19 foi identificada em dezembro de 2019 e proliferou rapidamente a nível global, culminando numa vasta pandemia. A doença dissemina-se principalmente através de gotículas respiratórias produzidas quando um indivíduo infetado tosse, espirra ou fala, tornando a transmissão de humano para humano o principal canal para a propagação do vírus.
A COVID-19 manifesta uma vasta gama de sintomas que variam de leves a graves. Os indicadores iniciais mais frequentemente encontrados incluem febre, tosse seca e fadiga. No entanto, pode provocar complicações mais graves, como síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA), pneumonia, falência de órgãos e, potencialmente, levar a desfechos fatais — predominantemente em adultos mais velhos e indivíduos com condições de saúde pré-existentes. Pesquisas emergentes também sugerem que o impacto da COVID-19 se estende além do trato respiratório, abrangendo uma gama mais ampla de sistemas orgânicos, incluindo cardiovascular, gastrointestinal, renal e neurológico.
Vários estratagemas foram empregados na tentativa de contrabalançar o alcance catastrófico da pandemia de COVID-19, incluindo testes extensivos, rastreamento de contactos de casos confirmados, implementação de métodos de quarentena, promoção do distanciamento social, bem como a formulação de vacinas e terapêuticas. Uma compreensão abrangente da composição genética e da trajetória evolutiva do SARS-CoV-2 é imperativa na elaboração de procedimentos de controlo eficazes e na contenção da propagação do vírus. O sequenciamento de próxima geração (NGS) ascendeu à proeminência como uma técnica instrumental na decifração do mapa genético do SARS-CoV-2; isto permite, assim, que os investigadores monitorem a sua transmissão, analisem mutações emergentes e formulem intervenções específicas ao contexto.
Mecanismo do SARS-CoV-2
O que é a Sequenciação de Próxima Geração do COVID-19?
A NGS de COVID-19 envolve a utilização de metodologias de sequenciação genómica de ponta para a análise da composição genética do SARS-CoV-2, o agente causador da COVID-19. As metodologias de NGS permitem uma sequenciação rápida e de alta capacidade dos genomas virais, proporcionando informações inestimáveis sobre o panorama genético, trajetórias evolutivas e dinâmicas de transmissão do SARS-CoV-2. Ao sequenciar de forma abrangente a totalidade do genoma viral, os investigadores podem discernir assinaturas mutacionais, delinear linhagens virais e investigar a gênese de variantes emergentes.
O advento da tecnologia NGS provocou uma mudança de paradigma na nossa capacidade de investigar doenças infecciosas, incluindo a COVID-19, ao fornecer uma vista panorâmica da arquitetura genómica viral com uma celeridade e precisão sem igual. Divergindo dos modos de sequenciação convencionais, que implicam prazos prolongados e fluxos de trabalho laboriosos, a NGS capacita os investigadores a sequenciar simultaneamente inúmeros fragmentos de DNA, reduzindo assim de forma significativa os custos temporais e financeiros associados à aquisição de dados genómicos. Esta escalabilidade e eficácia tornam a NGS um ativo indispensável para a análise de epidemias virais e para a elaboração de contramedidas direcionadas com precisão.
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Quais são os Métodos de Sequenciação para COVID-19
As metodologias de sequenciação para a COVID-19 abrangem um espectro de técnicas que facilitam a investigação do genoma viral, elucidando assim a sua arquitetura genética, paisagem mutacional e cinética de transmissão. Estas metodologias são fundamentais para decifrar os fundamentos patofisiológicos do vírus, informar intervenções de saúde pública e aprimorar modalidades de diagnóstico e terapêuticas.
Sequenciação de Amplicões
Dentro do âmbito do NGS para COVID-19, direcionado sequenciação de amplicões emerge como uma técnica fundamental, caracterizada pela amplificação seletiva e sequenciação de segmentos designados do genoma viralEste método envolve o design de primers que visam regiões conservadas dentro do genoma do SARS-CoV-2, facilitando a amplificação e subsequente sequenciação de segmentos fundamentais, incluindo, mas não se limitando ao gene da proteína spike ou ao gene da RNA polimerase dependente de RNA (RdRp). A utilização da sequenciação de amplicons direcionados permite a identificação rápida e económica de variantes virais e mutações, fornecendo assim informações críticas sobre a dinâmica evolutiva e as nuances epidemiológicas do vírus.
Sequenciação por Captura Híbrida
Sequenciação por captura híbrida abrange a captura e subsequente sequenciação do genoma viral completo através da utilização de sondas complementares meticulosamente adaptadas para se ligarem a segmentos genómicos definidos. Esta metodologia assegura uma cobertura exaustiva do genoma viral, facilitando a identificação de novas variantes e mutações. De particular importância para investigações de vigilância e epidemiológicas, o sequenciamento por captura híbrida fornece informações detalhadas sobre a heterogeneidade genética do vírus e a sua cinética de transmissão.
Sequenciação do genoma completo do SARS-CoV-2 utilizando enriquecimento por amplicão em mosaico e hibridação de iscas.
Metagenómica de Shotgun
Sequenciação metagenómica por shotgun surgiu como uma ferramenta fundamental para a deteção imparcial e caracterização abrangente de patógenos virais em amostras complexas, como espécimes clínicos ou matrizes ambientais. No contexto da COVID-19, o sequenciamento metagenómico facilita a identificação do SARS-CoV-2 em amostras de pacientes, revelando simultaneamente a presença de outros patógenos respiratórios. Graças ao sequenciamento de todos os ácidos nucleicos inerentes a uma dada amostra, as metodologias metagenómicas proporcionam a capacidade de descobrir co-infecções, delinear interações microbianas e identificar potenciais variáveis de confusão que influenciam a progressão da doença. Notavelmente, o sequenciamento metagenómico tem-se mostrado instrumental na análise das dinâmicas complexas da transmissão do SARS-CoV-2 e na investigação de surtos em diversos contextos epidemiológicos.
sequenciação metagenómica shotgun da COVID-19
Sequenciação do Genoma Completo
Sequenciação do Genoma Viral Completo, um ramo da NGS, tem-se revelado um elemento vital na compreensão da distribuição global e diversidade genética da COVID-19. Sem limitações impostas por alvos genéticos preferenciais, o WGS assume a tarefa de sequenciar o genoma viral completo, abrangendo tanto regiões codificantes como não codificantes. Esta análise abrangente permite a deteção de mutações sem precedentes, facilita o rastreamento da proliferação de linhagens virais específicas e oferece insights sobre quaisquer características genómicas associadas à virulência ou transmissibilidade. Reconhecendo as suas contribuições significativas, torna-se evidente que o WGS tem sido instrumental na descoberta do surgimento e propagação global de novas variantes do SARS-CoV-2, incluindo Alpha, Beta, Gamma e Delta.
Sequenciação do genoma completo para revelar as mutações pontuais do genoma do SARS-CoV-2
Plataformas de Sequenciação de Longa Leitura
Sequenciação de leitura longa plataformas, tipificadas pela Oxford Nanopore Technologies, induziram transformações radicais na abordagem utilizada para a análise genómica do SARS-CoV-2. Estas plataformas inovadoras superam os sistemas tradicionais de sequenciação de leituras curtas, gerando leituras de ADN prolongadas que facilitam a construção de genomas virais completos num único e contínuo conjunto de dados. Os dados genómicos exaustivos, obtidos através de sequenciação de long-read, permitem a execução de múltiplas aplicações fundamentais para decifrar as complexidades do vírus SARS-CoV-2.
Na avaliação do SARS-CoV-2, a sequenciação de longas leituras apresenta múltiplas superioridades. Um ganho significativo é a geração de leituras extensas, capacitando os investigadores a percorrer terrenos genómicos multifacetados, incluindo sequências repetitivas e variantes estruturais. Esta funcionalidade revela-se especialmente pertinente na delimitação da estrutura genómica do SARS-CoV-2, que manifesta complexidades estruturais exemplificadas por estruturas secundárias de RNA e disparidades de sequência. Além disso, as plataformas de sequenciação de longas leituras simplificam o processo de isolamento de subtipos virais e mutantes, equipando-nos com profundas percepções sobre as rotas da evolução viral e modalidades de transmissão.
Fluxo de trabalho de sequenciação de próxima geração do SARS-CoV-2 (MinION), desde a amostra até à análise de sequências.
Análise Comparativa dos Métodos de NGS para o Coronavírus
| Aspeto | Sequenciação de Amplicões Direcionada | Captura Híbrida | Metagenómica de Shotgun | Sequenciação de Ultra-Alta Vazão | Sequenciação do Genoma Completo |
| Necessidades de Teste | Exige primers específicos que visem regiões conhecidas do genoma viral. | Exige sondas que visam sequências virais específicas. | Deteção imparcial de todo o material genético numa amostra | Requer plataformas Oxford Nanopore | Requer plataformas de sequenciação de alto rendimento. |
| Velocidade e Tempo de Resposta | Prazo de resposta rápido; Normalmente dentro de horas a dias. | Prazo de resposta moderado; Normalmente de dias a semanas. | Prazo de entrega mais longo; Normalmente de dias a semanas. | Tempo de resposta rápido; Normalmente dentro de horas a dias. | Tempo de resposta rápido; Normalmente dentro de horas a dias. |
| Escalável e Rentável | Escalável e rentável para regiões específicas | Escalável, mas pode ser dispendioso devido ao design e síntese da sonda. | Escalável, mas pode exigir recursos computacionais significativos. | Altamente escalável, mas pode ser dispendioso devido a equipamentos e reagentes. | Altamente escalável, mas pode ser dispendioso devido a equipamentos e reagentes. |
| Identificar Patógenos Novos | Capacidade limitada de identificar patógenos novos fora das regiões alvo. | Capacidade limitada de identificar patógenos novos além das sequências capturadas. | Capacidade de identificar patógenos novos com base em dados de sequência | Capacidade de identificar patógenos novos com base em dados de sequência | Capacidade de identificar patógenos novos com base em dados de sequência |
| Rastreamento de Transmissão | Capacidade limitada de rastrear a transmissão | Capacidade limitada de rastrear a transmissão | Capacidade de rastrear a transmissão com base em semelhanças genómicas. | Capacidade de rastrear a transmissão com base em semelhanças genómicas | Capacidade de rastrear a transmissão com base em semelhanças genómicas |
| Detetar Mutações | Alta sensibilidade para detetar mutações conhecidas | Alta sensibilidade para detetar mutações conhecidas | Capacidade de detetar mutações novas em todo o genoma viral | Capacidade de detectar mutações novas em todo o genoma viral | Capacidade de detectar mutações novas em todo o genoma viral |
| Identificar Co-Infeções e Doenças Complexas | Capacidade limitada de identificar co-infecções ou doenças complexas. | Capacidade limitada de identificar co-infecções ou doenças complexas | Capacidade de identificar co-infecções ou doenças complexas | Capacidade de identificar co-infecções ou doenças complexas | Capacidade de identificar co-infecções ou doenças complexas |
| Detetar Resistência Antimicrobiana | Não aplicável para a deteção de resistência antimicrobiana. | Não aplicável para a deteção de resistência antimicrobiana. | Capacidade limitada de detetar resistência antimicrobiana sem análise específica. | Capacidade limitada de detetar resistência antimicrobiana sem uma análise específica. | Capacidade limitada de detetar resistência antimicrobiana sem análise específica. |
Aplicação de NGS para COVID-19
Perspetivas sobre Vigilância Genómica e Epidemiologia
A tecnologia NGS funciona como um recurso inestimável no que diz respeito ao rastreamento da trajetória evolutiva e dispersão global do SARS-CoV-2. Ao empregar genomas virais colhidos de amostras de pacientes, os cientistas têm a capacidade de detectar o surgimento de novas variantes, ao mesmo tempo que identificam mutações genéticas ligadas a alterações na virulência, transmissibilidade e evasão imunológica. As principais contribuições da CD Genomics em projetos de vigilância genómica em larga escala enriqueceram significativamente a nossa compreensão da epidemiologia da COVID-19 e da modalidade de transmissão.
Habilitar Precisão em Testes Diagnósticos
A utilização de metodologias centradas em NGS potencia de forma significativa a precisão diagnóstica para a COVID-19, além de facilitar a deteção de variantes genéticas que podem influenciar a infectividade viral e a resposta a medicamentos. O sequenciamento de derivados de RNA viral a partir de extratos de pacientes permite que o NGS identifique o SARS-CoV-2 com alta precisão e o distinga de outros patógenos respiratórios. Além disso, o NGS pode detetar mutações virais associadas à resistência a medicamentos, gerando informações críticas para orientar futuras estratégias de tratamento e direcionar a descoberta de medicamentos antivirais.
Orientação do Desenvolvimento de Vacinas
A rápida evolução de vacinas eficazes contra a COVID-19 está fortemente enraizada numa compreensão abrangente do genoma viral e as suas características antigénicas. O NGS oferece uma capacidade aprimorada para tipificar antígenos do SARS-CoV-2 e distinguir epítopos imunogénicos que desencadeiam respostas imunológicas protetoras. Ao sequenciar os isolados virais colhidos de diferentes regiões geográficas e coortes de pacientes, os investigadores podem conceber designs de vacinas que visam setores conservados do genoma viral, diminuindo assim a probabilidade de mutações de escape à vacina.
Intervenções Inspiradoras em Saúde Pública
A vigilância genómica impulsionada por NGS serve como um pilar fundamental na informação de intervenções estratégicas de saúde pública destinadas a conter a disseminação da COVID-19 e a mitigar as suas repercussões entre populações vulneráveis. Ao delinear clusters de transmissão e rastrear as origens dos surtos, o NGS capacita a implementação de medidas de quarentena direcionadas, esforços de rastreio de contactos e protocolos de isolamento. Além disso, a riqueza de dados genómicos fornecida pelo NGS facilita a formulação de diretrizes baseadas em evidências sobre a alocação de vacinas, protocolos de distanciamento social e restrições de viagem, aumentando assim a eficácia das estratégias de gestão da pandemia.
Perguntas Frequentes
A: Como é que os vírus são sequenciados?
As plataformas de NGS facilitam a deconstrução de genomas virais a partir de espécimes biológicos, como sangue ou secreções respiratórias, em unidades discretas e manejáveis para análise. O processo começa com a extração do material genético viral da amostra. Segue-se a fragmentação dos nucleotídeos, resultando em sequências constituintes menores. Estes fragmentos são posteriormente introduzidos em plataformas de sequenciação de alto rendimento, gerando simultaneamente uma variedade de sequências de DNA em miniatura que somam milhões. Utilizando uma gama de ferramentas de biologia computacional, estas sequências fragmentadas são reassembladas em extensas sequências contíguas, coloquialmente denominadas "reads". Estes reads epitomizam coletivamente o completo plano genético do vírus. É esta abordagem sofisticada que permite a elucidação rápida e precisa do genoma viral, um fator crítico no estudo da evolução viral, na dinâmica de transmissão e para a geração de protocolos de diagnóstico potentes e vacinas eficazes.
A: Como é que o sequenciamento do genoma desempenhou um papel importante durante a pandemia de COVID-19?
A: A inauguração do sequenciamento genómico foi fundamental na gestão de vários aspectos da pandemia de COVID-19. Mais significativamente, promoveu a rápida identificação e elucidação do novo coronavírus SARS-CoV-2, o patógeno associado à doença COVID-19. Através do sequenciamento genómico de amostras virais recolhidas de pacientes, a comunidade científica conseguiu revelar a composição genética do vírus, abrangendo a sua origem, variações e associação evolutiva com outros coronavírus. As informações obtidas foram vitais para interpretar a dinâmica de transmissão do patógeno, monitorizar a sua propagação mundial e promover a formulação de testes diagnósticos eficazes e vacinas.
Além disso, o sequenciamento genómico confirmou a identificação de variantes emergentes do SARS-CoV-2 à medida que a pandemia se desenrolava. Ao realizar sequenciamento genético em espécimes virais de diversos pontos temporais e geográficos, os investigadores conseguiram distinguir mutações incorporadas no genoma viral que conferiam certas vantagens, como uma maior transmissibilidade ou resistência a anticorpos. O monitoramento atempado dessas variantes forneceu às instituições de saúde pública os dados necessários para executar intervenções específicas para modular a sua distribuição e ajustar as estratégias de vacinação em conformidade.
Além disso, o emprego de sequenciação genómica forneceu aos investigadores os meios para analisar a resposta a nível molecular do hospedeiro à invasão do SARS-CoV-2. Através da análise detalhada dos planos genéticos dos infectados, os cientistas adquiriram uma compreensão dos mecanismos que impulsionam a gravidade da doença, as respostas imunes e os potenciais alvos terapêuticos. As percepções derivadas destes estudos contribuíram profundamente para a génese de protocolos de tratamento e estratégias terapêuticas personalizadas na gestão de pacientes com COVID-19.
Referências:
- Goswami, C., Sheldon, M., Bixby, C. et al. Identificação de variantes do SARS-CoV-2 utilizando sequenciação viral para o programa de vigilância genómica dos Centros de Controlo e Prevenção de Doenças. BMC Doenças Infecciosas 22, 404 (2022).
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- John G, Sahajpal NS, Mondal AK, Ananth S, Williams C, Chaubey A, Rojiani AM, Kolhe R. Sequenciação de Nova Geração (NGS) em COVID-19: Uma Ferramenta para Diagnóstico de SARS-CoV-2, Monitorização de Novas Estirpes e Modelação Filodinâmica em Epidemiologia Molecular. Questões Actuais em Biologia Molecular. 2021
- Hossain MU, Ahammad I, Bhattacharjee A, Chowdhury ZM, Hossain Emon MT, Chandra Das K, Keya CA, Salimullah M. Sequenciação do genoma completo para revelar as mutações pontuais do genoma do SARS-CoV-2 em isolados do Bangladesh e os seus efeitos estruturais nas proteínas virais. RSC Adv. 2021
- Koskela von Sydow, A., Lindqvist, C.M., Asghar, N. et al. Comparação do sequenciamento do genoma completo do SARS-CoV-2 utilizando enriquecimento de amplicon em mosaico e hibridização de iscas. Sci Rep 13, 6461 (2023).
- Hourdel V, Kwasiborski A, Balière C, Matheus S, Batéjat CF, Manuguerra JC, Vanhomwegen J, Caro V. Caracterização Genómica Rápida do SARS-CoV-2 por Sequenciação Direta Baseada em Amplicões Através da Comparação do Sistema MinION e do Illumina iSeq100TM. Front Microbiol. 2020
- Ke, S., Weiss, S.T. & Liu, YY. Dissecando o papel do microbioma humano na COVID-19 através de genomas montados a partir de metagenomas. Nat Commun 13, 5235 (2022).
