Protocolo de Sequenciação de Bisulfito com Representação Reduzida (RRBS)

Digestão de DNA Genómico com MspI

Adicione 100 ng (em 25 μL) de ADN genómico a um tubo de 0,2 mL e mantenha a tira de oito tubos em gelo.
2. Prepare uma mistura mestre de 10 Buffer Tango (3 μL) e MspI (10 U/μL) (2 μL) e mantenha a mistura mestre em gelo. Adicione 5 μL da mistura mestre ao tubo de 0,2 mL contendo DNA genómico. Misture por pipetagem e feche a tira de oito tubos com uma tira de oito tampas.
3. Coloque a tira de oito tubos (0,2 mL) num termociclador e execute o seguinte programa térmico para a digestão com MspI: 37°C durante 120 min; mantenha a 4°C (tampa aquecida a 50°C).

Reparação de Fim e dA-Tailing

1. Centrifugue a tira de oito tubos (0,2 mL) contendo DNA digerido com MspI. Remova a tira de tampa de oito cuidadosamente, sem salpicar a solução de DNA nos tubos. Mantenha a tira de oito tubos em gelo. Adicione 1 μL de mistura de dNTP para RRBS e 1 μL de Fragmento Klenow (exo-) a cada tubo e misture por pipetagem (32 μL no total). Feche os tubos com uma nova tira de tampa de oito.
2. Coloque a tira de oito tubos (0,2 mL) numa máquina de termociclagem e execute o seguinte programa térmico: 30°C durante 20 minutos e 37°C durante 20 minutos; mantenha a 4°C (tampa aquecida a 50°C).
3. Adicione 64 μL (2 volumes) de esferas AMPure XP à solução de DNA. Realize a purificação com as esferas AMPure XP e elua o DNA com 18 μL de Tris–Cl a 10 mM (pH 8.5). Transfira 17.7 μL da solução de DNA eluído para um novo tubo de oito tubos (0.2 mL).

Ligação de Adaptadores

1. Mantenha o ADN eluído no tubo de oito tubos (0,2 mL) em gelo. Adicione 2,3 μL do Buffer de Reação NEBNext Ultra II End Prep ao ADN eluído (20,0 μL no total).
2. Prepare uma mistura mestre para o NEBNext Ultra II Ligation Master Mix (10,0 μL) e o NEBNext Ligation Enhancer (0,33 μL), ambos incluídos no reagente 5 na Subsecção 2.1. Misture a mistura mestre pipetando para cima e para baixo dez vezes. Adicione 10,33 μL da mistura mestre ao DNA eluído e misture pipetando para cima e para baixo três vezes. Adicione 0,83 μL do NEBNext Methylated Adaptor (2 μM) a cada tubo e misture pipetando para cima e para baixo dez vezes (31,16 μL no total). Feche a tira de oito tubos com uma nova tira de oito tampas.
3. Coloque a tira de oito tubos num ciclista térmico e execute o seguinte programa térmico: 20 °C durante 60 min; mantenha a 4 °C (tampa aquecida a 50 °C). Após remover a tira de oito tampas, mantenha a tira de oito tubos sobre gelo. Adicione 1 μL de Enzima de Reagente de Excisão Específica de Uracilo, misture por pipetagem e feche a tira de oito tubos com uma nova tira de oito tampas. Coloque os tubos num ciclista térmico e execute o seguinte programa térmico (Programa D): 37 °C durante 15 min; mantenha a 4 °C (tampa aquecida a 50 °C). Armazene os tubos contendo DNA ligado ao adaptador a -20 °C até ao dia seguinte.
4. Adicione 48 μL (1,5 volumes) de esferas AMPure XP à solução de DNA. Realize a purificação com as esferas AMPure XP e elua o DNA com 20 μL de Tris–Cl a 10 mM (pH 8,5).

Conversão de Bisulfito de DNA Ligado a Adaptadores

1. Realize a conversão de bisulfito de DNA ligado a adaptadores utilizando o EZ Methylation Gold Kit. O programa térmico necessário para a conversão de bisulfito é de 98°C durante 10 min e 64°C durante 150 min, mantendo a 4 °C (tampa aquecida a 105°C). Adicione 130 μL de reagente de conversão CT ao DNA purificado ligado a adaptadores (20 μL) e divida a solução em dois tubos de 0,2 mL (75 μL cada). Coloque a fita de oito tubos no termociclador e inicie o programa. Após a conclusão, combine os dois alíquotas de 75 μL em um tubo. Realize os procedimentos subsequentes de acordo com o protocolo do fabricante do EZ Methylation Gold Kit. Elua o DNA convertido em bisulfito com 11 μL de M-Elusion Buffer.

Amplificação por PCR

1. Transfira 10,0 μL de DNA tratado com bisulfito para um tubo de 0,2 mL. Adicione 1,25 μL do primer i7 (10 μM) e 1,25 μL do primer i5 (10 μM) ao DNA tratado com bisulfito e misture brevemente. Adicione 12,5 μL de 2 KAPA HiFi Hot Start Uracil+ Ready Mix e misture por pipetagem (25,0 μL no total).
2. Realize a amplificação por PCR utilizando as seguintes condições de ciclagem térmica (Programa F): 98°C durante 45 s para a desnaturação inicial, nove ciclos de 98°C durante 15 s, 60°C durante 30 s e 72°C durante 30 s para a amplificação e 72°C durante 1 min para a extensão final; manter a 4°C (tampa aquecida a 105°C). As amostras de DNA amplificadas podem ser mantidas durante a noite a 4°C num ciclista térmico ou por mais tempo a -20°C.

Controlo de Qualidade da Biblioteca

1. Quando o Kit de DNA de Alta Sensibilidade é utilizado, 1 μL de cada uma das bibliotecas RRBS purificadas é submetido à análise eletroforética baseada em microcapilares.
2. Meça a molaridade de cada biblioteca (para a faixa de 200 bp–1000 bp). Verifique a distribuição do tamanho dos fragmentos de cada biblioteca.

Sequenciação

1. Sequenciação de teste na plataforma MiSeq e reajuste da concentração de DNA da biblioteca: Prepare mais de 2 μL de solução a 2 nM para cada biblioteca. Junte 2 μL de cada uma das bibliotecas a 2 nM (um total de 16 μL no caso de oito bibliotecas). Para uma sequenciação de teste utilizando um Kit de Reagentes Nano MiSeq v2 (300 ciclos), misture 92 μL de Tris–Cl a 10 mM (pH 8.5), 2 μL do pool da biblioteca a 2 nM e 1 μL da Biblioteca de Controlo PhiX v3 a 1 nM (95 μL no total) num tubo de 1,5 mL. Adicione 5 μL de NaOH a 2 N à mistura de 95 μL, misture por vortexação e deixe o tubo à temperatura ambiente durante 5 minutos para desnaturar a mistura de DNA da biblioteca. Adicione 500 μL de Buffer A gelado, misture e mantenha a solução sobre gelo durante 5 minutos. A concentração final da solução da biblioteca desnaturada (600 μL no total), incluindo 20% da quantidade da Biblioteca de Controlo PhiX v3 para equilibrar a cor da baixa diversidade de nucleotídeos, é de 8,3 pM. Realize a sequenciação de teste na plataforma MiSeq utilizando o fluxo de trabalho Generate FASTQ.
2. Após a conclusão da corrida MiSeq, verifique as proporções de índices das bibliotecas RRBS e recalcule a concentração das bibliotecas de acordo com as proporções de índices.
3. Realizar sequenciação em larga escala na plataforma HiSeq X. Preparar um pool de bibliotecas RRBS suficiente para sequenciação.