Por que a deteção de variantes suporta apenas humanos e não outras espécies, e quais são as limitações?

A deteção de variantes de sequenciamento PacBio HiFi suporta todas as espécies. A razão pela qual os resultados atuais são principalmente humanos é que o genoma de referência humano atual é o mais preciso.

Qual é a vantagem da PacBio em comparação com a Nanopore em leituras HiFi?

A principal vantagem do sequenciamento SMRT da PacBio é que não há erro sistemático, razão pela qual as leituras HiFi são tão precisas.

Qual é a profundidade mínima de sequenciamento necessária para uma montagem HiFi padrão? Quanto de profundidade de sequenciamento seria melhor?

De um modo geral, depende de quantos ploidias o genoma montado específico possui. Tomando o genoma humano como exemplo, recomendamos um mínimo de 15X-20X; se o genoma tiver mais de um haplótipo, é necessário aumentar os dados para 10X HiFi. Mas também depende da complexidade do genoma; se for um genoma complexo, pode ser necessário um adicional de 20X de dados HiFi para mais um haplótipo.

A construção de bibliotecas com volume inicial ultra-baixo requer genomas abaixo de 500M, podemos fazer outras espécies além de artrópodes, como insetos?

Por enquanto, apenas testámos insetos e artrópodes, porque o conteúdo de DNA de indivíduos individuais dessas amostras é muito pequeno. Micro-organismos ainda não foram testados. Para esclarecer, o genoma deve ser inferior a 500M, isto é para aplicação De Novo; se for re-sequenciamento, não há limite de tamanho do genoma.

Os dados HiFi são mais precisos, você pode estimar o tamanho do genoma?

Na verdade, todos eles podem ser estimados por k-mer.

O tamanho do genoma do flebotomíneo estimado pelo GenomeScope é de 306 Mb, e a montagem obtida é de 370 Mb, está subestimado pelo GenomeScope ou superestimado pela montagem?

Isto está principalmente relacionado à heterozigosidade genómica. Ao montar, se a diferença entre dois haplótipos for grande, então a diferença será refletida no resultado da montagem, e parecerá maior.

Qual é o processo e a enzima de PCR para a construção de bibliotecas com volume inicial ultra-baixo?

Utilizamos PCR de longo alcance. A PacBio fez muitos testes para selecionar as duas enzimas de PCR que podem cobrir melhor as regiões genómicas com alto e baixo GC tanto quanto possível. Após a interrupção da amostra, dividimos a amostra em duas partes, uma para PCR A e a outra para PCR B. O instrumento é capaz de obter a cobertura genómica mais uniforme.

Perguntas e Respostas sobre Sequenciamento SMRT da PacBio

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