Sequenciação do Genoma Completo Microbiano por Protocolo de NGS

Coleção de Células por Micromanipulação

1. Aplique 2 ml de 1× LB num tubo de PCR estéril de 0,2 ml e incube em gelo ou num refrigerador de PCR.
2. Anexe uma capilar de vidro com diâmetro de 30-100 mm a micromanipuladores. O diâmetro da capilar depende do tamanho das células que abrigam o simbionte bacteriano alvo.
3. Marque a posição correspondente à profundidade de um tubo PCR de 0,2 ml numa capilar de vidro de 15 mm de diâmetro e prenda-o ao outro micromanipulador.
Aplique 50 ml de sol U, cinco a dez vezes, na superfície interna da tampa.
5. Colete as células do protista hospedeiro.
6. Lave as células mais de quatro vezes.
7. Aplique 50 ml de NP-40 a 1% na parte interna da tampa de uma nova placa de Petri.
8. Cole uma única célula do protista hospedeiro com um novo capilar.
9. Substitua a tampa da placa de Petri no suporte pela tampa com 1% de NP-40.
Mergulhe a ponta do capilar de 15 mm de diâmetro no gotejo de 1% NP-40 e ajuste a pressão dentro do capilar manuseando o Cell Tram Vario. Tenha cuidado para não expulsar completamente o 1% NP-40 dentro do capilar. Bolhas tornam a imagem de contraste de fase pouco clara.
Mergulhe a ponta da capilar de 30–100 mm de diâmetro perto da ponta da capilar de 15 mm de diâmetro na gota de 1% NP-40 e liberte cuidadosamente a célula protista hospedeira.
12. Cole as células bacterianas o máximo possível com um capilar de 15 mm de diâmetro.
13. Libere as células coletadas em LB no tubo de PCR.

Amplificação do Genoma Completo

1. Incubar as células bacterianas coletadas em 1× LB no gelo ou num refrigerador de PCR durante 10 min.
2. Prepare e realize a reação de controlo negativo em paralelo com a reação da amostra.
3. Adicione 1,0 ml de NB e 22 ml de tampão de amostra, misture brevemente.
4. Preparar a mistura de reação: misturar 2,5 ml de solução enzimática e 22,5 ml de tampão de reação por pipetagem.
5. Adicione a mistura de reação à mistura da amostra.
Incubar a 30°C durante 2,5 h.
7. Pare a reação incubando a 65°C durante 10 min.
8. Verifique a amplificação por eletroforese em gel de agarose.
9. Purifique o ADN por precipitação com etanol.
Dissolva o precipitado em 50 ml de TE.
11. Meça a concentração de ADN.

Verificação da Pureza da Amostra

1. Prepare uma diluição de 1:200 da amostra purificada de WGA dissolvida em TE e da reação de controlo negativo sem purificação. Use 1/10 do volume como template para a PCR seguinte.
2. Realizar PCR utilizando conjuntos de primers específicos para os genes de rRNA SSU eubacterianos, arqueais e eucariotos, respetivamente, e também aqueles específicos para genes codificadores de proteínas, como hsp60 e gyrB. Realizar sempre o experimento de controlo negativo para a PCR. Condições da PCR: 95°C 30 s, 25 ciclos de (95°C 10 s, 50°C 30 s, 72°C 2 min), 72°C 4 min.
3. Se não houver amplificação por PCR da amostra de controlo negativo, quer para WGA quer para PCR, e apenas os PCRs utilizando primers específicos para bactérias gerarem produtos a partir da amostra de WGA, passe para o próximo passo.
4. Realizar a amplificação por PCR dos genes de rRNA 16S de eubactérias com uma polimerase de DNA com capacidade de correção.
5. Clone e sequencie os produtos de PCR com métodos standard.
6. Verifique se os genomas das espécies bacterianas-alvo predominam na amostra e avalie também as variações dentro da espécie do bactéria-alvo.

Sequenciação do Genoma

Após a verificação de pureza da amostra de WGA, prepare uma biblioteca para o sequenciador Illumina.

Referência:

1. Hongoh Y, Toyoda A. Sequenciação do genoma completo de uma bactéria inculturável usando amplificação do genoma completo[M]//Sequenciação de Próxima Geração de Alto Rendimento. Humana Press, Totowa, NJ, 2011: 25-33.