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Perguntas e Respostas sobre Sequenciação de Metagenomas

  • Perguntas Gerais

  • Quais são as diferenças entre metagenoma e diversidade microbiana?
    • (1) Diferença experimental: A diversidade microbiana foca principalmente na amplificação e sequenciação de sequências de genes do subunidade ribossómica pequena (16s rDNA ou 18s rDNA), enquanto sequenciação de metagenomas apenas requer fragmentação do DNA obtido por extração.
      (2) Diferenças analíticas: O sequenciamento da diversidade microbiana requer agrupamento de OTUs e só pode estudar a classe e a proporção de composição das espécies, enquanto o sequenciamento de metagenomas requer montagem de sequências e avaliação, podendo ser analisado e estudado simultaneamente a níveis de espécie, gene e função. Em resumo, a diversidade microbiana diz-nos principalmente quais os microrganismos que estão no ambiente, enquanto os metagenomas dizem-nos principalmente o que os microrganismos no ambiente podem fazer.
  • Como escolher entre sequenciação de metagenoma ou análise de diversidade?
    • A escolha baseia-se no propósito do seu estudo. Se se concentrar apenas na composição da comunidade do ambiente, incluindo quais géneros dominantes e não dominantes, então a diversidade microbiana é suficiente. Se precisar de explorar informações funcionais mais profundas com base na composição da comunidade, então o sequenciamento de metagenomas é recomendado. Alternativamente, pode ser utilizado um tamanho de amostra grande para a análise da diversidade microbiana, e amostras adequadas podem ser selecionadas para sequenciamento de metagenomas com base nos resultados da análise de diversidade para explorar as propriedades funcionais das espécies da comunidade de uma forma mais profunda.
  • Qual é a diferença entre metagenoma e metatranscriptoma?
    • Metagenoma é o estudo do DNA de todos os microrganismos no ambiente, e metatranscriptómico é o estudo do RNA de todos os microrganismos no ambiente. O metagenoma diz-nos o que todos os microrganismos no ambiente podem fazer, e o metatranscriptoma diz-nos o que todos os microrganismos no ambiente estão a fazer.
  • Como realizar a montagem de metagenomas?
    • Após obter a sequência do metagenoma, é necessário realizar uma análise de controlo de qualidade para remover os conectores e sequências de baixa qualidade antes de montar a sequência do gene. A montagem é o processo de unir uma série de sequências curtas obtidas por sequenciação numa sequência longa contínua, ou seja, é o processo de unir sequências curtas em sequências longas de Scaffolds.
  • Por que realizar a montagem de metagenomas?
    • 1) Menos tempo de computação para realizar comparações de sequências após a montagem.
      2) O genoma pode ser reconstruído.
      3) O comprimento atual da leitura de sequência para sequenciação de segunda geração é mais curto.
  • Quais são os fatores associados à eficácia da montagem de metagenomas?
    • O efeito da montagem de metagenomas está principalmente relacionado à quantidade de dados de sequenciação das amostras, à diversidade de espécies e à distribuição da abundância das espécies, o que pode tornar a montagem de metagenomas mais difícil do que a de espécies únicas, como as bactérias, e este é o foco da pesquisa atual em metagenomas que precisa ser superado.
  • Na montagem de metagenomas, por que não se pode combinar todos os dados das amostras para a montagem?
    • As espécies de alta abundância em diferentes amostras são muito diferentes; se todas as amostras forem misturadas para montagem, isso aumentará significativamente a complexidade dos dados e o efeito da montagem poderá ser pior.
  • No processo de montagem, é verdade que os genes comuns de alta abundância podem ser montados, mas os genes específicos de indivíduos de baixa abundância não podem ser montados?
    • 1) Devido à influência da profundidade de sequenciação e do custo da sequenciação, no atual artigo sobre metagenomas, a quantidade de dados de sequenciação é geralmente escolhida para ser 6G, o que pode detetar a maioria dos microrganismos na amostra, mas para algumas espécies de baixa abundância, é de facto provável que não possam ser montadas devido à profundidade de sequenciação;
      2) Na análise de metagenoma, geralmente se foca mais na composição de espécies de maior abundância. Se quiser fazer uma análise especial para espécies de baixa abundância, geralmente é necessário aumentar o volume de dados de sequenciação ou passar por algum tratamento especial no processo de pré-extração para enriquecer o máximo possível de espécies de baixa abundância e, em seguida, realizar a análise de sequenciação.
  • Qual é a quantidade recomendada de sequenciação para diferentes amostras?
    • Os volumes de sequenciação geralmente variam dependendo da complexidade da amostra ambiental. Para tipos de amostras com composição microbiana complexa, como amostras de solo, recomenda-se um volume de sequenciação de 12G, enquanto para amostras com composição microbiana relativamente simples, como amostras intestinais, recomenda-se geralmente um volume de sequenciação de 6G.
  • A sequenciação de metagenoma pode detectar informações sobre microrganismos como bactérias, fungos, protozoários, plâncton e vírus?
    • Sim, porque o ADN extraído pela sequenciação de metagenomas é o ADN total dos organismos na amostra ambiental, que pode ser sequenciado e analisado para detectar a informação de bactérias, fungos, protozoários, plâncton e vírus (vírus de ADN) no ambiente ao mesmo tempo.
  • Para projetos metagenómicos, como excluir a contaminação do hospedeiro?
    • 1) Ao recolher amostras, tente não retirá-las perto do tecido.
      2) Utilize o kit apropriado ao extrair.
      3) Se houver um genoma de referência, a contaminação do genoma do hospedeiro pode ser removida através de análise comparativa.
  • Pode a sequenciação de metagenoma ser realizada se houver uma grande quantidade de contaminação do hospedeiro e não houver uma sequência de referência do genoma do hospedeiro?
    • Não, se o DNA do hospedeiro contiver uma grande quantidade de DNA ambiental, após o sequenciamento, haverá uma contaminação séria, e não há sequência de genoma do hospedeiro conhecida para comparação e descontaminação, o que afetará a precisão da análise subsequente e a quantidade de dados disponíveis será pequena; no entanto, se a quantidade de contaminação do genoma do hospedeiro for pequena durante o processo de extração, a contaminação pode ser ignorada para a análise de dados posterior.
  • Quais genes são anotados pelo KEGG?
    • Todos os genes anotados pela nossa análise podem ser anotados, e você também pode selecionar as partes que lhe interessam.
  • Preciso de ter réplicas biológicas para uma meta-análise?
    • É melhor ter 5 ou mais réplicas biológicas, e recomenda-se mais de 10 réplicas biológicas para amostras humanas e animais devido à sua especificidade individual.

  • Preparação de Amostras

  • Quais são as considerações para a preparação de amostras de solo metagenómico?
    • Amostras de solo: Ao amostrar, remova o solo flutuante da superfície, escave a camada de solo a 5-20 cm de profundidade utilizando uma pá de fogo com etanol, após remover as raízes visíveis, o solo deve ser passado por uma peneira de 2 mm, cada amostra é recolhida de 3 locais de amostragem e misturada, onde o volume da amostra é de 5g, guarde as amostras de solo recolhidas em tubos de centrífuga estéreis, coloque-as a uma temperatura inferior a 0℃, após a recolha das amostras, transporte-as de volta para o laboratório para extração de DNA e utilize-as para a extração de DNA. Se não puder realizar o experimento imediatamente, por favor, congele rapidamente as amostras de solo no congelador a -20℃.
  • Quais são as considerações para a preparação de amostras de esterco metagenómico?
    • Amostras de fezes: As fezes podem ser armazenadas a -80°C. Como regra geral, é melhor recolher fezes internas para a extração do genoma, mas não é fácil de manusear. Devido às peculiaridades das fezes, recomenda-se recolhê-las e armazená-las a qualquer momento para alcançar uma extração de DNA otimizada.
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