Tipagem HLA por Protocolo de Sequenciação de Nova Geração

Amplificação de Biblioteca de Oligonucleotídeos Personalizada e Adição do Promotor T7

Amplificação de Biblioteca de Oligo Personalizada (Opcional)

1. Misture os seguintes componentes num tubo estéril livre de nucleases.

2. Realizar uma PCR.

3. Vortexar as esferas AMPure XP para ressuspender.
4. Adicione 90 μL de esferas ressuspendidas às reações de PCR. Misture pipetando para cima e para baixo pelo menos 15 vezes.
5. Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
6. Gire rapidamente o tubo e coloque-o num suporte magnético para separar as esferas do sobrenadante. Incube à temperatura ambiente até que as esferas estejam completamente claras da solução. Remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Não descarte as esferas.
7. Adicione 200 μL de etanol a 70% ao prato de PCR enquanto estiver no suporte magnético. Incube à temperatura ambiente durante 1 minuto e, em seguida, remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante.
8. Repita o último passo mais uma vez.
9. Deixe as contas secar ao ar durante 5 minutos enquanto a placa de PCR está no suporte magnético com a tampa aberta. Remova qualquer líquido residual com
uma pipeta.
10. Remova o tubo do íman. Elua o alvo de ADN das esferas para 42 μL de Tampão de Eluição (EB) ou 0,1× TE. Pipete para cima e para baixo pelo menos 15 vezes. Gire rapidamente o tubo e incube à temperatura ambiente durante 2–3 minutos.
11. Coloque a amostra num suporte magnético apropriado para separar as esferas do sobrenadante. Após a solução estar clara, transfira cuidadosamente 40 μL do sobrenadante para um novo tubo de PCR. As amostras podem ser armazenadas a 2–8 °C durante alguns dias ou a −20 °C para armazenamento a longo prazo.
12. Verifique o tamanho do produto.

Adição do Promotor T7

1. Misture os componentes da Tabela 3 num tubo estéril livre de nucleases.
2. Realizar uma PCR.
3. Para limpar e realizar a seleção de tamanho do produto de PCR, vortexar as esferas AMPure XP para ressuspender.
Adicione 50 μL (1×) de esferas AMPure XP ressuspendidas a 50 μL de solução de DNA. Misture bem agitando em vortex ou pipetando para cima e para baixo pelo menos 20 vezes.
5. Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
6. Coloque o tubo num suporte magnético para separar as esferas do sobrenadante. Após a solução estar clara, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo e não deite fora o sobrenadante.
Adicione 30 μL (0,6×) de esferas AMPure XP ressuspendidas ao sobrenadante, misture bem e incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
8. Coloque o tubo num suporte magnético para separar as esferas do sobrenadante. Depois de a solução estar clara, remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Tenha cuidado para não perturbar as esferas que contêm os alvos de DNA.

9. Adicione 200 μL de etanol a 80% preparado recentemente ao tubo enquanto este estiver no suporte magnético. Incube à temperatura ambiente durante 30 s e, em seguida, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
10. Repita o passo 9 uma vez.
11. Mantendo o tubo no suporte magnético, deixe as esferas secar ao ar durante 5 minutos.
12. Remova o tubo do íman. Elua o alvo de DNA das esferas para 32 μL de Tampão de Eluição (EB) ou 0,1× TE. Misture bem em
um misturador de vórtice ou por pipetagem para cima e para baixo, incubar durante 2 minutos à temperatura ambiente.
13. Coloque o tubo num suporte magnético até a solução ficar clara, aproximadamente 3 min. Transfira aproximadamente 30 μL do sobrenadante para um tubo limpo. As amostras podem ser armazenadas a 2–8 °C durante alguns dias ou a −20 °C para armazenamento a longo prazo.
14. Verifique o tamanho do produto.

Síntese de Isco de RNA a partir de Template de DNA (Transcrição com Biotin-UTP)

1. Descongele os componentes do kit, misture e gire em microcentrífuga para coletar as soluções no fundo dos tubos. Mantenha em gelo.
2. Montar a reação
3. Incubar a reação a 37 °C durante 14 h durante a noite.
Para a reação de 20 μL, adicione 70 μL de água livre de nucleases, 10 μL de Tampão de Reação 10× e 2 μL de DNase TURBO TM livre de RNases, misture e incube a 37 °C durante 15 min.
5. Limpe as sondas de RNA utilizando o Kit de Limpeza RNeasy MinElute da Qiagen de acordo com o protocolo do fabricante. Divida o volume da reação e use 50 μL por coluna. Elua duas vezes em 15 μL e 10 μL de água estéril livre de nucleases. O volume total de eluído é 25 μL.
6. Adicione 1 μL de inibidor de RNase ao RNA eluído.
7. Verifique a distribuição de tamanhos e a concentração.
8. Ajuste a concentração dos iscos para 100 ng/μL com água muito limpa livre de nucleases (utilize um tubo separado de água livre de nucleases apenas para este fim). A concentração de 100 ng/μL é considerada como solução estoque de iscos de RNA HLA.

Controlo de Qualidade da Biblioteca de Isótopos de RNA

Transcrição Reversa (Síntese de cDNA)

1. Misture e centrifugue brevemente cada componente do kit antes de usar e combine os componentes num tubo de 0,2 mL.

2. Incube o tubo a 65 °C durante 5 minutos, depois coloque no gelo durante pelo menos 1 minuto.
3. Prepare a Mistura de Síntese de cDNA.

4. Adicione 10 μL de Mistura de Síntese de cDNA à mistura de isótopos/primers de RNA, misture suavemente e colete por centrifugação breve.
5. Colete a reação por centrifugação breve. Adicione 1 μL de RNase H a cada tubo e incubar os tubos por 20 min a 37 °C. A reação de síntese de cDNA pode ser armazenada a −20 °C para armazenamento a longo prazo ou utilizada para qPCR imediatamente.

qPCR SYBR Green

1. Misture os componentes na placa óptica estéril de 96 poços para PCR em tempo real.

2. Execute as reações.

3. Se a síntese dos isótopos de RNA foi bem-sucedida, os valores de CT devem aparecer entre 10 e 15 ciclos. O NC não deve aparecer de todo ou em mais de 30 ciclos.

Preparação de Biblioteca

Fragmentação de gDNA

1. Para realizar a preparação do NEBNext End, misture os componentes em um tubo estéril livre de nucleases.

2. Misture por pipetagem seguida de uma rápida centrifugação para recolher todo o líquido das paredes do tubo.
3. Coloque num termociclador, com a tampa aquecida, e execute o programa.

4. Misture por pipetagem seguida de uma rápida centrifugação para recolher todo o líquido das paredes do tubo.
5. Incubar a 20 °C durante 15 min num ciclista térmico.
6. Adicione 3 μL de Enzima à mistura de ligação do passo anterior.
7. Misture bem e incube a 37 °C durante 15 minutos.
8. Limpeza do DNA ligado ao adaptador.
9. Adicione 86,5 μL de esferas AMPure XP ressuspendidas à reação de ligadura. Misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.
10. Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
11. Gire rapidamente o tubo e coloque-o num suporte magnético apropriado para separar as esferas do sobrenadante. Após a solução estar clara (cerca de 5 min), remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Tenha cuidado para não perturbar as esferas que contêm os alvos de ADN.
12. Adicione 200 μL de etanol a 80% recém preparado ao tubo enquanto este estiver no suporte magnético. Incube à temperatura ambiente durante 30 s e, em seguida, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
13. Repita o passo 12 uma vez.
Deixe as contas secar ao ar durante 5 minutos enquanto o tubo está no suporte magnético com a tampa aberta.
15. Remova o tubo/placa do íman. Elua o alvo de DNA das esferas adicionando 17 μL de 10 mM Tris-HCl ou 0,1× TE.
16. Misture bem pipetando para cima e para baixo, ou num misturador vortex. Incube durante 2 minutos à temperatura ambiente.
17. Gire rapidamente o tubo e coloque-o no suporte magnético.
18. Após a solução estar clara (cerca de 5 min), transfira 15 μL para um novo tubo de PCR para amplificação.
19. Misture os componentes em tubos de tira estéreis para iniciar a amplificação PCR, incluindo indexação. Execute o programa de PCR.
Adicione 45 μL de esferas AMPure XP ressuspendidas às reações de PCR (~50 μL). Misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.
21. Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
22. Gire rapidamente o tubo e coloque-o num suporte magnético apropriado para separar as esferas do sobrenadante. Após a solução ficar clara (cerca de 5 minutos), remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Tenha cuidado para não perturbar as esferas que contêm os alvos de DNA.
23. Adicione 200 μL de etanol a 80% ao prato de PCR enquanto estiver no suporte magnético. Incube à temperatura ambiente durante 30 s e, em seguida, remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante.
Deixe as contas a secar ao ar durante 5 minutos enquanto a placa de PCR está no suporte magnético com a tampa aberta.
25. Remova o tubo/placa do íman. Elua o alvo de DNA das esferas para 33 μL de 0,1× TE. Misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Gire rapidamente o tubo e incube à temperatura ambiente durante 2 minutos.
26. Coloque a amostra num suporte magnético apropriado para separar as esferas do sobrenadante. Após a solução estar clara (cerca de 5 min), transfira cuidadosamente 28 μL do sobrenadante para um novo tubo de PCR. As bibliotecas podem ser armazenadas a −20 °C.
27. Verifique a distribuição de tamanhos com um alíquota da biblioteca.

Enriquecimento Direcionado (Baseado em Iscas)

Hibridação

1. Para hibridação singleplex (500 ng de DNA de entrada), dilua a solução stock de iscas de RNA HLA (100 ng/μL) na proporção de 1:5 com água livre de nucleases.
2. Para hibridização multiplex:
(a) 8 amostras (62,5 ng de DNA de entrada cada uma), diluir a solução stock de sondas de RNA HLA 1:5 com água livre de nucleases.
(b) 6 amostras (31,25 ng de DNA de entrada cada uma), dilua a solução stock de sondas de RNA HLA 1:5 com água livre de nucleases.
3. Configure o programa num termociclador. Este programa ajudará durante o pré-aquecimento dos componentes e, eventualmente, realizará a incubação a 65 °C para hibridação.
4. Prepare a mistura da biblioteca num tubo livre de nucleases e agite com um vortex.
5. Prepare a mistura de hibridação num tubo livre de nucleases e agite com um vortex.
6. Prepare a mistura de captura num tubo livre de nucleases e agite com um vortex.
7. Coloque a mistura da biblioteca num termociclador. Assim que o passo 2 do ciclo for alcançado, coloque o tubo com a mistura de hibridação no termociclador para realizar a pré-aquecimento. Quando o passo 3 do termociclador for alcançado, adicione o tubo da mistura de captura ao termociclador para realizar a pré-aquecimento deste componente também. O passo 4 do termociclador representa a hibridação. Quando este passo for alcançado, adicione 7 μL da mistura da biblioteca pré-aquecida e 13 μL da mistura de hibridação pré-aquecida à mistura de captura pré-aquecida. Misture suavemente por pipetagem.
8. Incube a reação de hibridação a 65 °C durante 36 h.

Recuperação de Híbrido de DNA-Bait

1. Transfira 50 μL de esferas magnéticas para um novo tubo de 1,5 mL.
2. Pelotas de pellet usando um suporte de partículas magnéticas e descarte o sobrenadante.
3. Adicione 200 μL de Buffer de Ligação às esferas para lavar. Vortexe o tubo durante 5–10 s, coloque-o num suporte magnético por 2 min para sedimentar as esferas e remova e descarte o sobrenadante.
4. Resuspenda as esferas em 200 μL de Tampão de Ligação.
6. Transfira a solução de hibridização para o Tampão de Ligação/Esferas e incube por 30 minutos à temperatura ambiente. Separe as esferas com um suporte magnético por 2 minutos e remova o sobrenadante.
7. Adicione 500 μL de Tampão de Lavagem 1 às esferas e agite brevemente para ressuspender. Incube durante 15 minutos à temperatura ambiente. Pelote as esferas com um suporte de partículas magnéticas durante 2 minutos e remova o sobrenadante.
8. Adicione 500 μL de Tampão de Lavagem 2 a 65 °C às esferas e agite brevemente para misturar. Incube por 10 minutos a 65 °C. Pelote as esferas com um suporte de partículas magnéticas por 2 minutos e remova o sobrenadante.
9. Repita o passo 8 duas vezes, totalizando três lavagens a 65 °C. Certifique-se de que todo o tampão adicional seja removido.

Eluição do DNA Alvo

1. Adicione 50 μL de Tampão de Eluição preparado recentemente às esferas.
2. Vortex durante 5–10 s para misturar.
3. Incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
4. Pelletize as esferas e transfira o sobrenadante para um tubo contendo 70 μL de Tampão de Neutralização.

Purificação com Esferas AMPure XP

1. Adicione 120 μL de esferas AMPure XP e incube durante 5 minutos à temperatura ambiente.
2. Incubar durante 5 minutos à temperatura ambiente.
3. Gire rapidamente o tubo e coloque-o num suporte magnético apropriado para separar as esferas do sobrenadante. Após a solução ficar clara, remova cuidadosamente e descarte o sobrenadante. Tenha cuidado para não perturbar as esferas que contêm os alvos de DNA.
4. Adicione 200 μL de etanol a 80% enquanto o tubo está no suporte magnético. Incube à temperatura ambiente durante 30 s e, em seguida, remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
Secar 5 min à temperatura ambiente.
6. Remova o tubo do íman. Adicione 30 μL de 0,1× TE. Misture bem pipetando para cima e para baixo pelo menos 10 vezes. Gire rapidamente o tubo e incube à temperatura ambiente durante 2 minutos.
7. Coloque a amostra num suporte magnético apropriado para separar as esferas do sobrenadante. Após a solução estar clara, transfira cuidadosamente 28 μL do sobrenadante para um novo tubo de PCR.

Amplificação de Alvo Enriquecido

1. Prepare a mistura de PCR em gelo num tubo livre de nucleases e misture por pipetagem.
2. Coloque os tubos num termociclador e execute o programa.
3. Purifique o DNA com as Esferas AMPure XP.
4. Validar e quantificar um alíquota da biblioteca enriquecida.

Sequenciação NGS de Biblioteca Enriquecida

1. Carregue o HiSeq2500 com a biblioteca enriquecida e realize uma sequenciação em pares utilizando o Kit HiSeq® SBS v4 (250 ciclos).
2. Forneça os ficheiros fastq demultiplexados da corrida de sequenciação para a análise de dados.

Referência:

1. Wittig M, Juzenas S, Vollstedt M, et al.Tipagem HLA de alta resolução por sequenciação de próxima geração de DNA alvo fragmentado aleatoriamente[M]//Tipagem HLA. Humana Press, Nova Iorque, NY, 2018: 63-88.