Deteção do Metilação de Citosina em Todo o Genoma por Sequenciação em Tempo Real de Molécula Única

Tse OYO, Jiang P, Cheng SH, Peng W, Shang H, Wong J, Chan SL, Poon LCY, Leung TY, Chan KCA, Chiu RWK, Lo YMD
PNAS 02 de Fevereiro de 2021 118 (5) e2019768118

Resumo

5-Metilcitosina (5mC) é um tipo importante de modificação epigenética. A sequenciação por bisulfito (BS-seq) tem limitações, como a degradação severa do DNA. Usando sequenciação em tempo real de moléculas únicas, desenvolvemos uma metodologia para examinar diretamente a 5mC. Esta abordagem examinou holisticamente os sinais cinéticos de uma DNA polimerase (incluindo a duração entre pulsos e a largura do pulso) e o contexto da sequência para cada nucleotídeo dentro de uma janela de medição, denominada modelo cinético holístico (HK). A janela de medição de cada molécula de DNA de dupla hélice analisada compreendia 21 nucleotídeos com uma citosina em um sítio CpG no centro. Utilizámos DNA amplificado (não metilado) e DNA tratado com M.SssI (metilado) (sendo M.SssI uma metiltransferase CpG) para treinar uma rede neural convolucional. A área sob a curva para diferenciar estados de metilação usando tais amostras foi de até 0,97. A sensibilidade e especificidade para a deteção de 5mC em todo o genoma com resolução de base única atingiram 90% e 94%, respetivamente. O modelo HK foi então testado em fragmentos híbridos humano-murinos em que cada membro do híbrido tinha um estado de metilação diferente. O modelo também foi testado em moléculas de DNA genómico humano extraídas de várias amostras biológicas, como camada leucocitária, tecidos placentários e tumorais. Os níveis gerais de metilação deduzidos pelo modelo HK estavam bem correlacionados com os obtidos pela BS-seq (r = 0,99; P < 0,0001) e permitiram a medição de padrões de metilação específicos de alelos em genes impressos. Em conjunto, esta metodologia forneceu um sistema para análises genéticas e epigenéticas simultâneas em todo o genoma.

Mais informações em: https://www.pnas.org/content/118/5/e2019768118