Diretrizes para Submissão de Amostras
Perguntas e Respostas sobre Sequenciamento de Exomas
Questões Gerais
- É necessário ter um genoma de referência para o sequenciamento do exoma completo?
- Sim, se o genoma de referência não estiver disponível, a sequência da espécie estreitamente relacionada deve ser fornecida, mas a fiabilidade dos resultados da captura não pode ser garantida. Porque a sonda de captura é projetada com base na sequência de referência desde que não seja recomendado se a região alvo for conhecida por ter uma grande discrepância em relação à proporção do genoma de referência, como a deleção de inserção de um grande fragmento.
- Por que a sequenciação de exões precisa ser comparada com o genoma completo na análise, em vez de diretamente com a região-alvo?
- Primeiro, o região-alvo é geralmente curto em relação ao genoma completo e pode ser descontínuo, e se a região alvo for extraída separadamente, isso afetará o efeito da comparação de sequências na borda da região. Em segundo lugar, é impossível avaliar a qualidade da captura, como a taxa de off-target, a razão on-target, etc.
- Quantas vezes de cobertura são geralmente recomendadas para o sequenciamento do exoma completo?
- Geralmente, 100× ou 150×. Uma ploidia de cobertura mais alta, para medir variantes genéticas heterogéneas, pode detectar uma pequena percentagem de mutações. Além disso, a cobertura de sequenciação do exoma é aleatório, de modo que uma cobertura média mais alta ajuda a garantir que a maioria das regiões tenha cobertura suficiente de ploidia.
- Qual é a importância da profundidade de sequenciamento do exoma completo? Como é que a profundidade de sequenciamento é convertida?
- A profundidade de sequenciamento representa o número de vezes que a sequência é coberta pelo conjunto de sondas. Quanto maior o número, mais precisa é a identificação dos resultados de sequenciamento e mais precisa é a análise estatística subsequente. Se estiver a realizar estudos de tumores e mutações de baixa frequência, recomenda-se que a profundidade de sequenciamento seja de pelo menos 150× ou mais. Se apenas estiver a analisar SNPs clássicos e mutações não de baixa frequência, a profundidade de sequenciamento deve ser de pelo menos 30× ou mais. Método de conversão da profundidade de sequenciamento: a eficiência geral de captura da região-alvo é de 60-70%, o tamanho da região-alvo da captura de exões é de cerca de 60Mb, ou seja, profundidade de sequenciamento = 10G*60%/60Mb = 100×.
- Que tamanho de deleção de fragmento pode ser detetado pela sequenciação do exoma completo?
- Aproximadamente 50pb de deleções de fragmentos podem ser detectadas. Uma vez que a cobertura do sequenciamento do exoma é muito desigual, se houver grandes deleções, é impossível determinar se isso se deve ao fato de a hibridização não as ter capturado ou se estão ausentes. O que pode ser medido até agora é a deleção encontrada em uma leitura. O comprimento de uma leitura também é de 150pb, portanto, deleções de fragmentos abaixo de 50pb podem ser medidas a partir de. sequenciação de exões.
- A sequenciação do exoma completo pode ser utilizada para a análise de CNV? Que outros métodos estão disponíveis para a deteção de CNV?
- O sequenciamento do exoma completo tem um processo de captura por hibridização, portanto, existe um problema de eficiência na captura por hibridização. A eficiência de hibridização de cada exon é diferente, e a sua competição homóloga também é diferente, pelo que a cobertura de diferentes exões é muito variável. Assim, em geral, o sequenciamento de exões não pode ser utilizado para a deteção de CNV. No entanto, na investigação do câncer, o CNV pode ser detetado utilizando controles de tecido canceroso e paracanceroso. Existem dois outros métodos convencionais para detetar CNV, um é reessequenciamento do genoma completo e o outro é com microarranjos SNP.
- A sequenciação do exoma completo pode ser utilizada para a deteção de metilação em regiões alvo? Pode ser realizada a captura de RNA?
- A deteção de metilação da região-alvo pode ser realizada diretamente utilizando um produto de sequenciação de captura de metilação. O princípio é semelhante ao sequenciamento de captura de alvo, no qual uma sonda especialmente desenhada é utilizada para capturar e enriquecer a região-alvo de interesse para o investigador, sendo depois sequenciada e a metilação detetada após o tratamento com bisulfito.
- Consegue capturar amostras com uma mistura de várias espécies?
- Sim, desde que o fragmento alvo capturado tenha um genoma de referência correspondente, pode ser capturado pela sonda. Exemplos incluem sequências virais integradas no genoma do hospedeiro, sequências parasitas misturadas no sangue, sequências microbianas de baixa abundância em amostras ambientais, etc. Uma vez que a proporção dessas sequências em uma amostra mista é frequentemente muito baixa, a eficiência do uso de métodos tradicionais de re-sequenciamento pode ser muito baixa, exigindo volumes de sequenciamento muito elevados para obter uma profundidade de cobertura suficiente, enquanto gera uma grande quantidade de dados redundantes. O sequenciamento por captura de alvo tem uma vantagem definitiva neste aspecto.
- Existe um indicador para a eficácia da captura de exões?
- Devido às limitações da tecnologia de sequenciação, existem algumas sequências duplicadas, bases "N" indeterminadas, qualidade da amostra e outros fatores que podem não estar cobertos.
- Pode a captura de exões ser realizada em fragmentos com alto conteúdo de GC?
- Sim, mas haverá algum impacto na eficiência de captura destes fragmentos. Da mesma forma, fragmentos de baixa complexidade e fragmentos com bases ambíguas também são difíceis de capturar. Ao projetar as sondas, os técnicos da Euromonitor aumentarão o número de cobertura e a densidade das sondas de acordo com a cobertura, e enviarão os resultados de captura esperados ao cliente para confirmação. Além disso, para capturar exões inteiros, UTRs, etc., podem ser utilizados conjuntos de sondas pré-definidos. Estas sondas são projetadas para otimizar os fragmentos que são mais difíceis de capturar e melhorar a eficiência de captura correspondente.
- Qual é a eficiência de captura de exões?
- O sequenciação de exões o processo envolve um processo de hibridização. Existem muitas partes do cromossoma humano que são homólogas a exões, e estas partes homólogas provavelmente serão capturadas no processo de hibridização também. Chamamos à razão da parte dos exões sequenciados em relação a todas as sequências sequenciadas a eficiência de captura. A eficiência de captura não afeta a qualidade dos dados, mas apenas a proporção efetiva dos dados.
- Quando escolher a captura de exões completos? Quando escolher uma captura com sondas personalizadas?
- Existem produtos de sondas pré-definidos para humanos e algumas espécies comuns para captura de todo o exon, com várias versões da sonda de todo o exon humano otimizadas. Se a região alvo for grande e todos os exões (dezenas de Mb ou mais), recomenda-se optar pela captura de todo o exon diretamente, uma vez que os exões inteiros são melhor capturados com um conjunto de sondas mais bem projetado e a um custo mais baixo. Para fragmentos alvo menores, ou para regiões além dos exões que também são de interesse, recomenda-se sondas personalizadas.
- Posso fazer sequenciação de captura de exões para espécies convencionais, espécies com genomas novos, imperfeitos ou cheios de erros?
- Sim, não há restrições de espécies no sequenciação de captura de alvo plataforma, apenas são necessárias as informações da sequência do genoma e as informações da região alvo. Mesmo que o genoma de referência de uma espécie seja relativamente novo, impreciso ou até muito diferente, a sequenciação por captura pode ser projetada. No entanto, em conformidade, as sondas de captura são projetadas com base nas sequências fornecidas pelo cliente, e, portanto, a precisão dos resultados não pode ser totalmente garantida.
- Podem amostras degradadas ser sujeitas a pós-bancagem? Quais são as implicações para os dados e análises subsequentes?
- Se as amostras estiverem severamente degradadas, não é recomendado construir uma biblioteca em risco e a taxa de sucesso na construção de uma biblioteca é baixa; se as amostras estiverem severamente degradadas, o impacto na construção de uma biblioteca de exoma humano é principalmente uma baixa eficiência de captura, baixo volume de dados eficaz e baixo mapeamento adequado.
Preparação de Amostras
- Qual é o impacto da viscosidade da amostra, da contaminação por impurezas micelares e da contaminação por RNA na construção da biblioteca? Qual é a taxa de sucesso aproximada da construção da biblioteca?
- No entanto, se a contaminação por proteínas e outras impurezas for grave, isso afetará a quantificação e a eficiência da enzima na construção da biblioteca, o que reduzirá a taxa de sucesso da construção da biblioteca; a contaminação por RNA afeta principalmente a quantificação das amostras e a separação do DNA na construção da biblioteca; portanto, se existir contaminação por RNA, recomenda-se a digestão de RNA se a quantidade total e a qualidade das amostras forem adequadas.
- Pode um único pedaço de tecido ser co-extraído para DNA e RNA? Qual é o método de extração?
- Existem dois métodos de co-extração, um é cortar o tecido em duas partes e extrair o DNA e o RNA separadamente; o outro é usar um kit de co-extração de DNA/RNA para extrair, mas geralmente o DNA e o RNA são facilmente degradados após a extração.
- Quais são as razões para a baixa taxa de extração de DNA de amostras FFPE?
- As amostras FFPE são geralmente armazenadas durante muitos anos e foram severamente degradadas pelo formaldeído; além disso, as amostras FFPE costumam ser preciosas, por isso os professores enviam menos amostras.
- Como separar amostras de plasma para extração de cf/ctDNA?
- Colete 5 mL de sangue periférico (geralmente coletado de manhã ou ao início da manhã), transfira rapidamente para um tubo de anticoagulação EDTA, inverta e misture cuidadosamente (para evitar hemólise); separe o plasma dentro de 1 hora (à temperatura ambiente) ou 2 horas (a 4°C): centrifugue a 1.000 rpm durante 10 minutos a 4°C, aspire cuidadosamente o plasma para um tubo EP limpo de 1,5 mL (tenha cuidado para não aspirar o plasma para dentro). Em seguida, centrifugue a 12.000 rpm durante 10 minutos a 4°C para remover células residuais ou detritos, aspire cuidadosamente o volume desejado de sobrenadante para um novo tubo EP, marque com uma caneta de marcador à base de óleo, armazene em um refrigerador de ultra-baixa temperatura a -80°C, evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, e transporte a amostra em gelo seco.
Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.
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