Triagem e Sequenciação CRISPR: Introdução, Fluxo de Trabalho e Aplicações

Em competição com os bacteriófagos, as bactérias e arqueias evoluíram formas únicas de defesa, que incluem os sistemas CRISPR/Cas, os sistemas imunes de bactérias e arqueias para resistir à invasão de DNAs ou RNAs estrangeiros, reconhecer os ácidos nucleicos invasores estrangeiros e cortá-los para defesa imune.

Atualmente, os sistemas CRISPR/Cas tornaram-se ferramentas de investigação eficientes e convenientes, amplamente utilizadas no campo da engenharia genética. Por exemplo, num processo de edição de genes induzido por CRISPR/Cas9, a enzima Cas9 cliva especificamente o DNA de cadeia dupla com a orientação do sgRNA (RNA guia pequeno). E a célula alcança a edição do gene alvo através da junção de extremidades não homólogas (NHEJ) ou reparo dirigido por homologia (HDR).

Entretanto, os sistemas CRISPR/Cas podem ser facilmente ampliados para a triagem em todo o genoma. Triagem CRISPR é uma abordagem de triagem genética em larga escala que gera e analisa uma população de células mutantes para facilitar a descoberta de genes-chave ou sequências genéticas em um determinado tipo celular. A ideia básica da triagem CRISPR é eliminar cada gene no genoma que possa ser importante, sendo apenas um gene por célula.

O fluxo de trabalho de Triagem e Sequenciação de Knockout de CRISPR/Cas9 em Todo o Genoma

1. Construção da Biblioteca de sgRNA: os sgRNAs são projetados computacionalmente, sintetizados, amplificados por PCR e clonados num sistema de entrega de vetores.

2. Triagem: Introduzir a biblioteca de sgRNA, Cas9 e outros componentes necessários nas células. Em seguida, os clones desejados são selecionados e o DNA é extraído.

3. Sequenciação: PCR e sequenciação de nova geração.

4. Medição e Análise: os sgRNAs são recuperados, analisados e os genes associados identificados.

Aplicações de Triagem e Sequenciação CRISPR

Para identificar genes relacionados com doençasA triagem CRISPR/Cas9 em todo o genoma pode ser utilizada para identificar genes relacionados com doenças, o que é importante para a descoberta de novos alvos para fármacos e fornece estratégias para o tratamento. Por exemplo, as tecnologias de triagem CRISPR/Cas9 são uma bênção para a terapia do câncer – os genes-alvo podem ser obtidos e analisados para encontrar genes com uma maior correlação com a capacidade de sobrevivência das células tumorais. Ao suprimir a expressão desses genes, o ciclo celular tumoral é bloqueado e a apoptose é induzida, enquanto as células sanguíneas normais não são tão afetadas. A triagem CRISPR/Cas9 também pode ser utilizada para estudar genes relacionados com a metástase, para explorar como os vírus invadem e prejudicam as células hospedeiras, entre outros.

Para estudar sequências não codificantesAs sequências de ADN não codificantes, que compõem cerca de 98 por cento da sequência do genoma humano, incluem RNA não codificante, elementos regulatórios cis e trans, íntrons, pseudogenes, telómeros, sequências repetitivas, entre outros. Estudos demonstraram que as sequências não codificantes desempenham um papel fundamental na regulação da expressão génica, tumorigenese, regulação imunológica, ontogénese e muitos outros processos biológicos. O rastreio CRISPR em todo o genoma pode ser aplicado para estudar sequências de ADN não codificantes desconhecidas que são de grande importância para a compreensão da regulação génica, doenças e evolução biológica.

Para estudar redes regulatóriasA triagem genómica em larga escala com CRISPR/Cas9 tem sido amplamente aplicada em várias áreas da biologia celular. No entanto, a triagem de fenótipos é maioritariamente praticada dentro da proliferação celular, viabilidade, resistência a fármacos e expressão de genes reportadores, entre outros. Redes regulatórias biológicas mais complexas (como o transcriptoma e a interação genética) dentro das células necessitam de mais investigação. Ao combinar a tecnologia de triagem genómica CRISPR/Cas9 com sequenciação de células únicas, a expressão de sgRNA pode ser capturada com precisão, e as alterações no nível de transcrição genética nas células podem ser medidas. Ao mesmo tempo, uma grande quantidade de dados pode ser analisada de acordo com o modelo computacional, e a complexa rede genética pode ser representada.