Anotação de Elementos Regulatórios no Genoma do Peixe Zebra

Nos últimos vinte anos, o peixe-zebra emergiu como um organismo modelo amplamente adotado devido ao seu rápido desenvolvimento embrionário e à transparência dos seus embriões fertilizados externamente, tornando-o excepcionalmente adequado para a investigação do desenvolvimento. A sua compatibilidade com abordagens genéticas tanto de avanço como de retrocesso facilitou significativamente a descoberta de genes e a modelagem de doenças humanas. Em 2013, o Instituto Sanger conseguiu sequenciar o genoma do peixe-zebra, abrangendo uma vasta área de 1,5 milhões de metros quadrados. O genoma da zebrafish, que compreende aproximadamente 1,4 Gb e codifica um mínimo de 25.000 genes, é comparável em tamanho aos genomas de outros vertebrados e, curiosamente, mais de 70% dos genes humanos exibem homologia com os seus homólogos de zebrafish. No entanto, o genoma do zebrafish apresenta um desafio notável semelhante ao do genoma humano, principalmente na forma de anotações não codificantes.

Esta pesquisa implementou uma metodologia semelhante a outros projetos colaborativos, como o ENCODE. Aproveitando esta estratégia, os investigadores reexaminaram um substancial conjunto de dados previamente publicados, que totalizava quase 1.500, além de introduzirem mais de 350 novos conjuntos de dados. Estes conjuntos de dados abrangeram várias técnicas de alto rendimento, incluindo ChIP-seq para perfilagem de modificações de cromatina associadas a promotores e potenciadores. ATAC-seq para identificar regiões acessíveis no genoma, RNA-seq para a construção de modelos genéticos, a Análise de Captação da Expressão Génica (CAGE) para identificar os pontos finais de transcrição 5', e Hi-C ou 4C-seq para descobrir interacções intracromossómicas. Notavelmente, esta extensa coleção de conjuntos de dados abrangeu 15 estádios de desenvolvimento diferentes, bem como tecidos adultos, permitindo uma avaliação dinâmica das alterações genómicas durante a embriogénese. Os resultados deste estudo estão prontamente disponíveis e podem ser explorados através do UCSC Genome Browser.

Coleção e anotação abrangente de dados genómicos do desenvolvimento de zebrafish. (Baranasic) et al.., 2022)

Os autores aproveitaram o seu conjunto de dados para anotar meticulosamente elementos não codificantes dentro do genoma da zebrafish, com um foco principal em promotores e potenciadores. Para identificar regiões promotoras, iniciaram o processo utilizando RNA-seq dados para identificar modelos de genes. Subsequentemente, incorporaram leituras de CAGE, que capturam especificamente a extremidade 5' dos transcritos e correspondem à região do promotor. Esta abordagem meticulosa culminou na determinação precisa dos locais de início de transcrição.

É crucial notar que o conjunto de dados abrange vários estágios embrionários, oferecendo uma perspectiva temporal intrincada sobre como os promotores evoluem durante o desenvolvimento. Para validar a precisão deste "conjunto de promotores", os autores empregaram dCas9, uma enzima projetada para incapacitar o Cas9, impedindo assim a ligação de ativadores transcricionais nos promotores e, consequentemente, reduzindo a expressão gênica em locais de promotores selecionados. Notavelmente, direcionar dCas9 para os locais de início de transcrição definidos pelos dados de CAGE resultou em uma repressão gênica mais potente em comparação com os locais definidos pelas anotações do Ensembl, sublinhando a superior precisão dos primeiros na identificação de promotores ativos. Este recurso inestimável capacita os investigadores com uma base robusta para a realização de estudos de knockout.

Na sua busca por uma caracterização mais profunda dos promotores, os autores exploraram as modificações da cromatina, a dinâmica de acessibilidade ao longo do tempo de desenvolvimento e a avaliação da conservação de sequências. Estas análises abrangentes revelaram uma multitude de estruturas de promotores únicas, caracterizadas por padrões de ativação dinâmicos ao longo do desenvolvimento embrionário. Embora o significado biológico destes diversos padrões de ativação continue a ser um mistério, eles servem como um ponto de partida promissor para futuros experimentos e investigações orientadas por hipóteses.

Categorias de transcritos e verificação da extremidade 5′ em resolução de nucleotídeo único durante o desenvolvimento. (Baranasic) et al.., 2022)

Este estudo também oferece uma anotação inicial de potenciadores ativos dentro do genoma da zebrafish, alcançada através da integração de padrões de acessibilidade e modificação da cromatina. A sua análise abrangente levou à identificação de mais de 100.000 elementos que exibem atividade de potenciador prevista. Estes elementos podem ser classificados com base nos seus padrões de ativação dinâmica em vários estágios de desenvolvimento. Para confirmar a funcionalidade destes potenciadores, os investigadores avaliaram-nos através da co-expressão de RNAs de potenciadores da gaiola nuclear e compararam as suas descobertas com relatórios publicados anteriormente.

Subsequentemente, os autores aproveitaram os disponíveis. ATAC-seq de célula única dados para fazer avaliações preditivas da atividade específica de células de aproximadamente 40.000 potenciadores. Muitas dessas previsões encontraram apoio em análises de repórteres publicadas. O estudo aprofundou-se nas interações entre potenciadores e promotores, integrando dados de interações intracromossómicas utilizando conjuntos de dados Hi-C e 4C-seq. Esta análise revelou uma assinatura genómica distinta referida como a sequência H3K27ac, que partilha características comuns com super-potenciadores. Curiosamente, o cluster de genes H3K27ac parecia mais amplo e mais numeroso do que os super-potenciadores e estava ligado à expressão de genes de desenvolvimento precoce antes da especificação da linhagem.

De notável importância, os autores introduziram uma abordagem inovadora para comparar genomas de espécies distantes. Esta abordagem permitiu-lhes identificar elementos regulatórios de co-linhagem partilhados entre o rato e o peixe-zebra, sublinhando o potencial de conservação da sequência H3K27ac na regulação do genoma de vertebrados. Como resultado, a anotação exaustiva do genoma do peixe-zebra realizada pela iniciativa DANIO-CODE tem o potencial de facilitar a identificação de características regulatórias genómicas únicas, conservadas e relevantes para o desenvolvimento.

Classificação de elementos cis-regulatórios de desenvolvimento. (Baranasic) et al.., 2022)

O peixe-zebra, conhecido como um organismo modelo para estudos de desenvolvimento, tem-se mostrado inestimável na exploração de sequências não codificantes funcionais cruciais para a regulação transcricional e pós-transcricional. Antecipando as próximas etapas da pesquisa, espera-se que aprofundemos a caracterização funcional dos elementos identificados nas nossas análises iniciais. Por exemplo, isso pode envolver ensaios de reportadores, que podem ser realizados de forma rápida e fácil em embriões vivos de peixe-zebra.

Além disso, a inclusão de técnicas moleculares de célula única é imperativa para aprimorar a nossa compreensão. As investigações preliminares do DANIO-CODE basearam-se predominantemente em embriões inteiros, introduzindo potenciais complexidades na interpretação dos resultados atuais. Dada a escassez de linhas celulares de zebrafish, o progresso da tecnologia na análise molecular a nível de célula única e a sua subsequente aplicação a embriões de zebrafish serão fundamentais nas próximas fases do DANIO-CODE.

Referência:

1. Baranasic, Damir, et al. "Atlas multiómico com estratificação funcional e dinâmicas de desenvolvimento dos elementos cis-regulatórios de zebrafish." Genética da Natureza 54.7 (2022): 1037-1050.