Avanços na Detecção de Patógenos associados a mortes neonatais através de Sequenciação Metagenómica

De acordo com dados de inquérito da Organização Mundial da Saúde, aproximadamente 5 milhões de crianças em todo o mundo perderam tragicamente a vida antes de atingirem a idade de 5 anos em 2021. Chocantemente, 46% dessas mortes devastadoras ocorreram no primeiro mês de vida, durante o que é conhecido como o período neonatal. Tradicionalmente, os modelos para determinar as causas de morte em crianças têm dependido fortemente de inferências sobre a causa da morte e da análise de dados de registo vital. No entanto, esses métodos frequentemente atribuem as mortes a uma única doença subjacente, tornando extremamente desafiador descobrir a verdadeira causa raiz dessas perdas dolorosas.

Nos últimos anos, houve um avanço promissor na compreensão das causas de morte em crianças através de uma técnica conhecida como amostragem de tecido minimamente invasiva pós-morte (MITS). Ao combinar a MITS com outras informações valiosas, agora podemos aprofundar-nos na caracterização das causas de morte neonatal. Esta abordagem permite-nos identificar não apenas os eventos imediatos que levam à morte, mas também os antecedentes e as causas subjacentes que, em última análise, resultam nesses desfechos trágicos.

Sequenciação de Próxima Geração Metagenómica (mNGS)

Atualmente, os ensaios convencionais, como os métodos de cultura tradicionais e os testes de amplificação de ácidos nucleicos, têm-se mostrado inadequados na deteção de patógenos responsáveis por mortes infecciosas em crianças. Entre no sequenciação de metagenoma de próxima geração (mNGS), que está pronta para enfrentar esses desafios. Ao contrário dos seus predecessores, o mNGS não depende de alvos pré-selecionados e possui a notável capacidade de identificar vírus, bactérias e fungos sem qualquer viés inerente. Este avanço promete uma compreensão mais detalhada do papel que vários patógenos desempenham na complexa teia de causas que levam à morte. Além disso, o mNGS permite-nos analisar a resistência a medicamentos antimicrobianos sem a necessidade de métodos baseados em cultura, permitindo-nos identificar genes de resistência antimicrobiana presentes nas amostras.

Nesta pesquisa, a equipa avaliou a eficácia de mNGS na identificação de patógenos associados a mortes neonatais. Fizeram isso examinando amostras de sangue e tecido pulmonar recolhidas através de MITS de neonatos pós-morte em Soweto, África do Sul. Surpreendentemente, os resultados de mNGS alinharam-se com aqueles obtidos através de métodos tradicionais de cultura e testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAAT) em impressionantes 90% dos casos, identificando os patógenos responsáveis por essas perdas trágicas. Além disso, o mNGS forneceu informações críticas sobre os perfis de resistência desses patógenos, revelando muitas bactérias multirresistentes.

A Análise Metagenómica de NGS Revela Patógenos e Genes de Resistência Antimicrobiana em Infeções Neonatais

A equipa de investigação realizou um estudo envolvendo 236 recém-nascidos elegíveis que, infelizmente, faleceram. Realizaram a Amostragem de Tecidos Minimamente Invasiva (MITS) em 153 destes recém-nascidos. As potenciais causas de morte (CoDs) foram diversas, com a maioria (53%) atribuída a complicações decorrentes do nascimento prematuro, enquanto 15% estavam ligadas a eventos intraparto e 13% resultaram de anomalias congénitas. Notavelmente, 88 casos estavam associados a causas confirmadas ou potenciais de doenças infecciosas.

Entre as mortes não relacionadas a doenças infecciosas, 16 casos foram incluídos como controlos. Entre os pacientes que sucumbiram a infecções, 31 tinham tecido pulmonar residual e amostras de sangue disponíveis para sequenciação de próxima geração metagenómica (mNGS) análise. Em 20 destes casos, os patógenos já eram identificáveis através de culturas rotineiras ante-mortem ou post-mortem ou testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAAT), mas apenas para amostras post-mortem.

Ao analisar o número médio de leituras de sequenciação mNGS ou a percentagem de leituras não relacionadas ao hospedeiro (leituras não mapeadas para o genoma humano), a equipa de investigação observou que os falecidos de controlo apresentavam uma percentagem mais baixa de leituras não relacionadas ao hospedeiro em comparação com os casos com causas de morte infecciosas. Notavelmente, entre os 20 casos com patógenos conhecidos, o mNGS identificou com sucesso o mesmo patógeno em 18 casos, alcançando uma impressionante concordância de 90%. Além disso, o mNGS revelou outros microrganismos potencialmente responsáveis por mortes neonatais, como Klebsiella aerogenes.

Em 11 casos em que as mortes foram atribuídas a infeções que não puderam ser identificadas preliminarmente utilizando métodos convencionais, o mNGS desempenhou um papel fundamental ao identificar potenciais patógenos em 9 destes casos. Os patógenos identificados exclusivamente por mNGS incluído Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, e Streptococcus mucinisAlém disso, em 14 casos com hemoculturas antemortem positivas, o mNGS detetou consistentemente os mesmos microrganismos em 86% desses casos.

A métrica de NGS metagenómica para leituras restantes após a filtragem de hospedeiros e qualidade. (Baillie et al., 2023)

A equipa de investigação analisou meticulosamente as leituras emparelhadas brutas extraídas da biblioteca de RNA mNGS para discernir os genes de resistência a antibióticos (AMR). Os resultados revelaram a presença de um substancial número de 32 genes AMR dentro do dados de mNGS, abrangendo genes associados à resistência a β-lactâmicos, aminoglicosídeos, sulfonamidas e outros. Notavelmente, os genes que codificam β-lactamases apresentaram uma diversidade notável, com a identificação de um total de 12 mutações distintas. Entre essas mutações, as encontradas no gene NDM-1 foram as mais prevalentes.

Ao realizar uma avaliação abrangente da abundância de genes de RAM, tornou-se evidente que os casos em que o patógeno foi identificado como a causa da morte (CoD) apresentaram um maior número de genes de RAM em comparação com mortes infecciosas em que o patógeno permaneceu não identificado.

Genes de resistência antimicrobiana (RAM) em amostras de neonatos que morreram de patógenos conhecidos e desconhecidos usando bibliotecas de RNA. (Baillie et al., 2023)

A equipa de investigação preparou meticulosamente bibliotecas de ADN para um total de 18 casos, categorizando-os em dois grupos distintos: um consistindo em 12 casos com patógenos identificados e o outro compreendendo 6 casos onde os patógenos permaneceram não identificados. Dentro do subconjunto de casos com patógenos conhecidos, as bibliotecas de ADN demonstraram a sua eficácia ao identificar com sucesso potenciais agentes causadores. Em seis ocasiões, o microrganismo associado à infeção foi inequivocamente identificado, com todos os casos a revelarem a presença de Acinetobacter baumannii, quer através de cultura ou através de testes de amplificação de ácidos nucleicos (NAAT).

Subsequentemente, a equipa aprofundou-se nas seis instâncias de A. baumannii amostras positivas mencionadas anteriormente. Através dos seus esforços diligentes, conseguiram gerar sequências genómicas abrangentes com uma notável completude, variando entre 92% a 99%. Notavelmente, todos estes genomas pertenciam ao tipo ST1, sublinhando a homogeneidade genética destas estirpes.

Notavelmente, entre os casos em que nenhum patógeno tinha sido inicialmente detetado, a biblioteca de DNA provou o seu valor ao revelar uma única instância de Klebsiella pneumoniae.

Filogenia do genoma completo dos genomas das 9 estirpes de Acinetobacter baumannii recolhidas de 6 mortes neonatais avaliadas nas bibliotecas de ADN para este estudo, juntamente com 6 estirpes de referência. (Baillie et al., 2023)

Subsequentemente, a equipa de investigação realizou uma análise minuciosa das leituras de bibliotecas de DNA emparelhadas brutas obtidas das amostras microbianas identificadas, focando na deteção de marcadores de resistência antimicrobiana (RAM). Nesta análise abrangente, descobriram um total de 29 genes RAM distintos que exibem resistência a β-lactâmicos, aminoglicosídeos e sulfonamidas. Notavelmente, entre estes genes, aqueles que codificam β-lactamases e aminoglicosídeos apresentaram uma diversidade notável, com cada categoria a compreender nove genes distintos.

Genes de resistência antimicrobiana (RAM) em amostras de neonatos que morreram de doenças infeciosas utilizando bibliotecas de ADN. (Baillie et al., 2023)

Os resultados deste estudo indicam fortemente que a utilização de clínicos sequenciação de próxima geração (NGS) metagenómica a amostragem de tecido minimamente invasiva pós-morte (MITS) pode revelar-se inestimável para identificar causas específicas de patógenos em mortes relacionadas com infeções neonatais. Além disso, esta abordagem diagnóstica pioneira tem o potencial de informar significativamente as estratégias de tratamento nas unidades de cuidados intensivos neonatais, facilitar a deteção precoce de infeções emergentes e perfis de doenças, e desempenhar um papel vital tanto na identificação como no controlo de surtos de infeções adquiridas em hospitais. Além disso, em países ou regiões com recursos limitados, a aplicação de mNGS oferece uma via promissora para avaliar a prevalência de patógenos específicos de doenças e identificar os perfis de genes de resistência a antimicrobianos predominantes, orientando assim o desenvolvimento direcionado de intervenções farmacêuticas.

Referência:

1. Baillie, Vicky L., et al. "Sequenciação metagenómica de amostras de tecido pós-morte para a identificação de patógenos associados a mortes neonatais." Comunicações da Natureza 14.1 (2023): 5373.