Integração da Metilação m6A e Análises de Célula Única para Desvendar a Heterogeneidade Celular

A sequenciação de célula única permite-nos dissecá-la intrincada paisagem da diversidade celular em várias amostras celulares. Isso abrange variações na composição da população celular, mudanças nas proporções celulares e distinções nos perfis de expressão génica entre diferentes tipos de células e amostras. Com dados de célula única, ganhamos a capacidade de identificar a influência específica das alterações na expressão génica dentro de tipos celulares individuais sobre todo o sistema. No entanto, as complexidades de como essas alterações na expressão génica ocorrem e os fatores regulatórios subjacentes permanecem elusivos dentro dos conjuntos de dados de célula única.

metilação m6A, uma modificação de RNA prevalente, desempenha um papel fundamental na modulação da estabilidade, localização, tradução, splicing e transporte do RNA. sequenciação de metilação m6A os dados fornecem uma lente através da qual podemos compreender os mecanismos que governam as alterações na expressão génica a partir de uma perspectiva de metilação de RNA, iluminando as complexidades do processo de modulação da expressão génica.

A amalgamação de dados de células únicas com dados de sequenciação de metilação m6A oferece uma visão mais abrangente dos mecanismos regulatórios que governam processos biológicos, permitindo uma compreensão mais profunda da heterogeneidade celular e da dinâmica da expressão génica.

YTHDF2 Aumenta a Imunidade Antitumoral através da Reprogramação de TAM

Neste estudo, os autores investigaram o papel da YTHDF2 na coordenação da reprogramação dos macrófagos associados a tumores (TAM) e o seu impacto na imunidade antitumoral através das células T CD8+. A pesquisa revelou informações convincentes sobre a interação entre YTHDF2, TAMs e a resposta imunitária em vários tipos de câncer.

• Expressão Elevada de YTHDF2 em Vários Tipos de Câncer
  Os autores examinaram inicialmente a base de dados pública TCGA e observaram que YTHDF2 apresentava uma expressão notavelmente alta em tecidos tumorais de câncer de mama (BRCA), adenocarcinoma colorretal (COAD), glioblastoma (GBM), adenocarcinoma retal (READ) e melanoma cutâneo (SKCM). Importante, encontraram uma correlação negativa entre a expressão de mRNA de YTHDF2 e os escores imunes, implicando uma possível ligação entre YTHDF2 e a resposta imune. Além disso, os dados de scRNA-seq de bases de dados públicas confirmaram a regulação positiva de YTHDF2 em várias amostras tumorais, em comparação com tecidos vizinhos ou normais, sugerindo uma tendência comum de superexpressão de YTHDF2 em tumores.
• A Deleção de YTHDF2 Aumenta o Fenótipo Antitumoral em TAMs
  Usando sequenciação de célula única de tumores B16-OVA de ambos os camundongos Ythdf2f/f e Ythdf2cKO, os autores descobriram um aumento na expressão de marcadores antitumorais e uma redução na expressão de marcadores protumorais em TAMs após a deleção de YTHDF2. Esta observação foi ainda validada através de separação celular, análise de identificação celular e análise de abundância diferencial de táxons celulares. Coletivamente, estas descobertas indicam que a deleção de YTHDF2 induz um programa antitumoral em TAMs.
• Melhoria da Apresentação Cruzada de Antígenos e Ativação de Células T CD8+
  A análise da comunicação celular demonstrou que macrófagos deficientes em YTHDF2 exibem uma maior apresentação cruzada de antígenos e ativação de células T CD8+. Isso sugere que o YTHDF2 desempenha um papel fundamental na modulação da interação entre macrófagos associados a tumores (TAMs) e células T, potencialmente influenciando a resposta imune anti-tumoral.

Análise da comunicação celular. (Ma et al., 2023)

• Regulação da Via de Sinalização IFN-γ-STAT1
  Os autores realizaram várias análises, incluindo análise GSEA, experimentos de qPCR, experimentos de fosforilação e ensaios funcionais, para identificar os principais genes e vias afetados pela deleção de YTHDF2. Os seus resultados revelaram que a deleção de YTHDF2 regula a via de sinalização IFNγ-STAT1 em macrófagos, que está associada à indução de um fenótipo anti-tumoral.
• Modificação de Metilação m6A e Estabilidade do mRNA do Stat1
  O estudo aprofundou-se nos mecanismos moleculares subjacentes ao papel do YTHDF2 na reprogramação dos TAM. Através de sequenciação m6A-seq e RIP-seq, os autores identificaram que a deleção do YTHDF2 aumenta a estabilidade do mRNA do Stat1 em macrófagos através da modificação de metilação m6A, lançando luz sobre os detalhes mecânicos da influência do YTHDF2.

Em resumo, este estudo fornece evidências convincentes de que a proteína YTHDF2, que lê m6A, reprograma os TAMs ao influenciar a via IFN-γ-STAT1. Esta reprogramação resulta numa melhor apresentação de antígenos pelos TAMs, modulando, em última análise, a imunidade antitumoral mediada por células T CD8+. Estas descobertas oferecem insights valiosos sobre a complexa interação entre as células imunes e o microambiente tumoral e têm implicações potenciais para a terapia do câncer.

METTL14 em Macrófagos Associados a Tumores: Impacto nas Células T CD8+

Neste estudo inovador, os autores empregaram uma abordagem abrangente para investigar o impacto da deficiência de METTL14 em macrófagos associados a tumores na disfunção das células T CD8+ e no crescimento tumoral. Através de uma série de experimentos integrados, sequenciação de células únicas, análise de enriquecimento funcional e RNA-seq, descobriram um novo mecanismo regulador envolvendo a metilação m6A. Este mecanismo revelou como a perda da metilase m6A METTL14 em macrófagos C1q+ leva a uma diminuição na modificação m6A do transcrito Ebi3 e a um aumento na expressão de EBI3 nos macrófagos. Isso, por sua vez, desencadeia disfunção nas células T CD8 infiltradas no tumor, com profundas implicações para a imunologia do câncer.

• Caracterização de Subpopulações de Macrófagos
  Para iniciar a sua investigação, os autores classificaram meticulosamente os monócitos e macrófagos em três subpopulações distintas utilizando dados de sequenciação de célula única. A subpopulação Mac c1, referida como macrófagos PTGS2, foi identificada como tendo papéis potenciais na angiogénese e hipoxia. Em contraste, a subpopulação Mac c2, conhecida como macrófagos C1q, exibiu características induzidas por interferão γ (IFN-γ), sugerindo interações com células produtoras de IFNγ, particularmente células T efetoras.

Caracterização de macrófagos associados a tumores por scRNA-seq. (Dong et al., 2021)

• Trajetórias de Diferenciação de Monócitos
  Os autores concentraram-se então nas trajetórias de diferenciação dos monócitos e observaram a diferenciação dos monócitos infiltrantes do tumor em macrófagos C1q ou PTGS2. Importante, identificaram fatores de transcrição, como Klf2 e Klf4, para a polarização dos macrófagos M2, que estavam elevados ao longo da trajetória dos macrófagos C1q, enquanto os macrófagos PTGS2 expressavam Jun e Ets1.
• Validação da Metilação m6A de RNA em Macrófagos
  Para validar a presença de metilação m6A de RNA em macrófagos, análises de RNA-seq em massa confirmaram que genes representativos de macrófagos C1q e macrófagos PTGS2, conforme identificados na análise de RNA-seq de célula única, eram reproduzíveis em MHCII em massa e subconjuntos de MHCII, respetivamente. Notavelmente, C1q, METTL14 e YTHDF2 foram predominantemente expressos em macrófagos CX3CR1MHCII, apoiando ainda mais a relevância destes achados.

O macrófago C1q+ é distinguido pela metilação de RNA m6A única. (Dong et al., 2021)

• Impacto da Deficiência de METTL14 na Imunidade Tumoral
  Subsequentemente, os autores exploraram os efeitos da deficiência de METTL14 em macrófagos no contexto da imunidade tumoral. Os seus experimentos envolvendo ratos com knockout específico de METTL14 em macrófagos revelaram uma capacidade anti-tumoral reduzida em comparação com ratos selvagens. Também observaram uma diminuição significativa na proporção de células T CD8 infiltrantes do tumor. Os dados de sequenciamento de célula única demonstraram que a deficiência de METTL14 em macrófagos levou a uma diminuição nas células T CD8 efetoras infiltrantes e a um aumento nas células T CD8 em estado intermediário, anormalmente ativadas e disfuncionais, no microambiente imunológico.
• Validação Funcional e Perspectivas Mecanísticas
  Experimentos de validação funcional revelaram ainda que macrófagos deficientes em METTL14 diminuíram a função de destruição das células T CD8 e aumentaram a expressão de receptores co-supressores. Isso indicou que macrófagos deficientes em METTL14 interromperam o equilíbrio da diferenciação das células T CD8, inibindo a ativação das células T CD8 efetoras e contribuindo para a disfunção das células T CD8. Integrando m6A-seq e dados de RNA-seq de macrófagos associados a tumores do tipo selvagem e deficientes em METTL14, os autores identificaram uma redução significativa nas modificações de m6A no mRNA de Ebi3 nos macrófagos deficientes em METTL14. Além disso, os níveis de mRNA de Ebi3 e a expressão da proteína foram significativamente aumentados.
• Potencial Terapêutico
  Para investigar mais a fundo os fundamentos mecanicistas dessas observações, os autores demonstraram que a neutralização de EBI3 com um anticorpo neutralizante de EBI3 restaurou a diferenciação de células T CD8 e aumentou as suas capacidades anti-tumorais em camundongos knockout condicionais. Estes resultados destacaram o papel da metilação mediada por METTL14 de Ebi3 em macrófagos C1q como um interruptor crucial na modelagem do microambiente tumoral em direção a um fenótipo imunossupressor. Importante, bloquear a regulação negativa da função das células T por Ebi3 contrariou efetivamente os efeitos imunossupressores induzidos pela perda de METTL14 em macrófagos associados ao tumor.

Referências:

1. Ma, Shoubao, et al. "YTHDF2 orquestra a reprogramação de macrófagos associados ao tumor e controla a imunidade antitumoral através de células T CD8+." Imunologia da Natureza 24.2 (2023): 255-266.
2. Dong, Lihui, et al. "A perda da metiltransferase de RNA N6-adenosina Mettl14 em macrófagos associados a tumores promove a disfunção das células T CD8+ e o crescimento tumoral." Célula Cancerígena 39.7 (2021): 945-957.