Desvendando Variações Estruturais Complexas e Mecanismos de Reparação de DNA através do Sequenciamento de Genoma Completo

HRD em Genomas de Câncer

Os genomas do câncer servem como um registo de alterações genéticas que surgem a partir de danos no DNA e processos defeituosos de reparação do DNA durante o desenvolvimento normal das células e a progressão da carcinogénese. Estas alterações genéticas manifestam-se como alterações somáticas generalizadas em cânceres deficientes em BRCA1 (BRCA1d) e BRCA2 (BRCA2d), principalmente ligadas a deficiências na recombinação homóloga (HR), uma via fundamental para reparar quebras de dupla fita (DSBs) nas células humanas. Alguns destes padrões de mutação podem representar mecanismos específicos propensos a erros de reparação de DSB que as células utilizam na ausência de HR funcional, potencialmente oferecendo biomarcadores valiosos para identificar defeitos de HR e orientar estratégias terapêuticas clinicamente relevantes.

A reparação DSB comprometida em células deficientes em HR (HRD) está frequentemente associada a interrupções na integridade estrutural do genoma, resultando em anomalias cito-genéticas distintas, como cromossomas radiais e pontes cromossómicas. Tanto a microarray como sequenciação do genoma completo (WGS) estudos revelaram padrões extensivos de deleções heterozigóticas (perda de heterozigosidade ou LOH) e outros desequilíbrios alélicos em cancros com deficiência em reparo por recombinação homóloga (HRD). Vale a pena notar que tais alterações no número de cópias também podem ser observadas em tumores com HR intacto (HRP) e não estão ligadas a tipos específicos de variantes estruturais (SVs)Paradoxalmente, as características genómicas distintivas que separam os tumores BRCA1d e BRCA2d dos tumores HRP incluem variantes de nucleótido único (SNVs), pequenas deleções caracterizadas por microhomologia, duplicações em tandem e deleções simples. Notavelmente, estas alterações têm um impacto mínimo na estrutura cromossómica. Os mecanismos subjacentes a como processos de reparação de DSB aberrantes dão origem a anomalias cito-genéticas associadas na presença de defeitos de HR permanecem pouco compreendidos.

Variações Estruturais Complexas e Mecanismos de Reparação em Cancros Deficientes em BRCA1 e BRCA2

Recentemente, foi publicado um artigo em NaturezaEste estudo, intitulado 'Cicatrizes de moléculas longas de reparação de DNA de backup em cancros deficientes em BRCA1 e BRCA2', aproveitou o poder de 46 leituras profundas de fitas. sequenciação do genoma completo (WGS) conjuntos de dados de cânceres da mama com mutações BRCA1 ou BRCA2. Além disso, a equipe realizou uma análise de mapeamento genómico em dados de WGS de leitura curta de milhares de tumores. Esta abordagem abrangente revelou uma classe única de rearranjos, denominada 'pares de reversão', que estão significativamente enriquecidos em cânceres deficientes em HR. Os autores propuseram um mecanismo para replicação e restauração independentes de HR para explicar o espectro completo dos resultados dos 'pares de reversão'. Esta descoberta lança luz sobre uma categoria distinta de rearranjos específicos para deficiências de BRCA1 ou BRCA2, que estão na base das anomalias citogenéticas observadas em células deficientes em HR.

Para explorar o papel intricado das variações estruturais complexas (SVs) em cancros associados à deficiência de recombinação homóloga (HRD), os investigadores deste estudo reuniram meticulosamente dados de 979 perfis de sequenciação de genoma completo, compreendendo principalmente tumores primários (95%). Estes tumores representavam quatro tipos distintos frequentemente ligados a defeitos de HR. Entre este conjunto de dados, havia 24 e 36 tumores a exibir inativação de ambos os alelos BRCA1 e BRCA2, juntamente com 487 tumores associados a anomalias da via de HR (HRP). Subsequentemente, os investigadores empregaram uma abordagem de mapeamento genómico integrado para analisar alterações no número de cópias e rearranjos, facilitando uma avaliação comparativa dos padrões de SV entre tumores deficientes em BRCA1 (BRCA1d), deficientes em BRCA2 (BRCA2d) e tumores com anomalias na via de HRP.

A WGS de LR revela fases cis e trans para topologias de pares recíprocos semelhantes.

Os resultados revelaram semelhanças notáveis nos perfis de SV entre os cânceres HRP e HRD, abrangendo SVs complexos. No entanto, surgiu uma exceção notável, uma vez que uma classe particular de SVs conhecida como "Complexos de Inserção em Tandem" (TICs) apresentou um enriquecimento significativo em tumores BRCA1d e BRCA2d.

As rearranjos clássicos reversos, caracterizados por translocações ou inversões em equilíbrio, são mecanismos que ocorrem sem qualquer perda ou ganho líquido de material genético, envolvendo um par de junções de DNA posicionadas adjacentes às extremidades quebradas dentro do mesmo ponto de quebra. No entanto, é essencial notar que muitos rearranjos, incluindo translocações e inversões, desviam ligeiramente desta definição clássica, exibindo características de quase-reversão. Estes SVs de quase-reversão, como os TICs, implicam alterações no número de cópias dentro de regiões genómicas intermédias referidas como "fragmentos de lacuna". A polaridade destas alterações é determinada pela orientação da junção das extremidades quebradas. Especificamente, os ganhos de cópias resultam de conexões entre extremidades quebradas e fragmentos de lacuna com uma polaridade positiva (+), enquanto as perdas de cópias ocorrem quando estas conexões envolvem os segmentos flanqueadores com uma polaridade negativa (-).

Embora as TICs estivessem notavelmente enriquecidas em cancros BRCA1d e BRCA2d, é importante notar que ainda eram discerníveis numa proporção substancial (36%) de tumores HRP. Isso sugere a possibilidade de descobrir padrões específicos de deficiência de HR através de uma análise mais abrangente de junções quase reversas.

Os pares recíprocos estão enriquecidos em tumores BRCA1d e BRCA2d.

Com base nessas hipóteses, os investigadores realizaram uma análise abrangente ao comparar as variações estruturais (SVs) em estreita proximidade entre diferentes genótipos. A sua investigação revelou que os padrões circulantes emparelhados eram notavelmente mais abundantes em cânceres deficientes em BRCA1 (BRCA1d) e BRCA2 (BRCA2d) quando comparados aos cânceres da população de alto risco (HRP). Esses padrões circulantes emparelhados são referidos como "pares reversos" ou "pares recíprocos."

Além disso, ao visualizar o comprimento e a polaridade dos fragmentos de lacuna dentro destes pares reversos, os investigadores identificaram três subpadrões distintos específicos para cancros deficientes em BRCA1 e/ou BRCA2:

• Em tumores deficientes em BRCA1 (BRCA1d), observaram pares reversos caracterizados por dois fragmentos de lacuna que variavam de 100 pares de bases a 100 quilobases de comprimento, ambos com polaridade positiva. Estes foram denominados "duplicados reversos" (rDups).
• Em tumores deficientes em BRCA2 (BRCA2d), os investigadores encontraram pares reversos com dois fragmentos de lacuna que variavam de 1 par de bases a 10 quilobases de comprimento, ambos com polaridade negativa. Estes foram denominados "deleções reversas" (rDel).
• Além disso, identificaram pares reversos contendo fragmentos de lacuna que variavam de 1 par de bases a 100 quilobases de comprimento, com polaridades opostas (positiva e negativa). Estes pares reversos estavam enriquecidos tanto em cânceres BRCA1d como BRCA2d e foram referidos como "deleção-duplicação reversa" (rDelDup).

Os investigadores realizaram leituras ligadas (LR) e padrão. sequenciação do genoma completo (WGS) em 46 amostras de tumor, cada uma emparelhada com a sua amostra normal correspondente. Estas amostras apresentaram mutações genéticas ou somáticas nos genes BRCA1 ou BRCA2. O sequenciamento de genoma completo de LR oferece uma cobertura abrangente do genoma, tanto das amostras tumorais como das normais, através da utilização de sequenciamento de leituras curtas com código de barras de longas moléculas de DNA. Estas moléculas de DNA alongadas desempenham um papel crucial na separação de pares reversos em haplótipos somáticos em fase, lançando luz sobre os mecanismos subjacentes e os resultados das variações estruturais (SVs).

Os resultados deste estudo demonstraram a consistência entre o mapeamento de WGS de LR e a análise de dados de WGS de leituras curtas previamente descrita. Além disso, o WGS de LR revelou uma visão significativa sobre pares reversos com orientações de rearranjo idênticas, produzindo dois resultados cromossómicos distintos que só podem ser distinguidos utilizando dados moleculares longos. O primeiro resultado, conhecido como "cis", envolve a replicação de um pequeno fragmento de DNA transferido para uma localização genómica distante. O segundo resultado, referido como "trans", representa uma translocação bem equilibrada ou uma inversão multi-megabase caracterizada por repetições substanciais (aproximadamente 10kb) em cada junção. Curiosamente, a investigação revelou que os pares trans-transversais são prevalentes em casos de rDup, rDel e rDelDup, contribuindo para extensos rearranjos em tumores BRCA1d e BRCA2d. Estes pares trans-reversos exercem efeitos cromossómicos consideráveis, potencialmente ligados a anomalias observáveis citogeneticamente tipicamente associadas à inativação de BRCA1 e BRCA2.

A WGS da LR revela vestígios de SSA em genomas BRCA2d.

Expressão Diferencial e Efeitos Específicos da População Potencialmente Impulsionados por Fatores Genéticos

Utilizando eQTLs, a nossa análise revelou a identificação de 9.150 loci eQTL associados a 5.198 genes distintos, dos quais 11% apresentaram padrões específicos de ancestralidade. Entre estes, 812 eQTLs exibiram especificidade de tipo celular, com 45% deles sendo predominantemente detectados em células mieloides. Além disso, identificámos 1.505 variantes de resposta estimulada por vírus, conhecidas como reQTLs, ligadas a 1.213 genes. Notavelmente, as bases genéticas da resposta mieloide mostraram especificidade viral, com variações entre populações celulares.

A nossa investigação sobre genes expressos diferencialmente entre populações e genes com efeitos diferenciais demonstrou que 56% e 60% deles, respetivamente, estavam associados a pelo menos um eQTL. Isto sugere que os genes que exibem a variação mais significativa baseada na população na expressão diferencial e nos efeitos são provavelmente influenciados pelo controlo genético, frequentemente ligado a loci de efeito substancial. Isto destaca a presença de diferenças populacionais em subconjuntos específicos de genes. Por exemplo, entre africanos e europeus, encontramos que uma única variante com forte diferenciação populacional poderia explicar 81-100% da variação na expressão do GBP7.

Os eQTLs e reQTLs contribuem para o risco de COVID-19. (Aquino et al., 2023)

Uma análise aprofundada revelou ainda a presença de SVs reversos em orientações cis e trans, cada uma exibindo características topológicas e de comprimento de feixe específicas que correlacionam com os mecanismos de reinício da replicação. Notavelmente, esses mecanismos abrangem resultados de meio-crossover e inserção de molde associados à replicação induzida por quebra (BIR). Com base nessas descobertas, é proposto um modelo preliminar, sugerindo que a BIR mediada por microhomologia pode explicar o espectro completo de mapeamento de pares reversos.

Além disso, LR WGS identificou uma via de reparo distinta conhecida como emparelhamento de cadeias simples (SSA) específica para defeitos no BRCA2 em cânceres humanos. Esta descoberta destaca uma estratégia única para reforçar a via de reparo em células com deficiência de recombinação homóloga (HRD).

Referência:

1. Setton, Jeremy, et al. "Cicatrizes de moléculas longas da reparação de DNA de backup em cancros deficientes em BRCA1 e BRCA2." Natureza (2023): 1-9.