Integração de ATAC-seq e RNA-seq para Análise de Redes Reguladoras de Genes em Plantas

A orquestração da expressão genética em plantas envolve interações intrincadas entre a estrutura da cromatina e a atividade transcricional. O advento de técnicas de sequenciamento de alto rendimento, particularmente ATAC-seq e RNA-seq, revolucionou o estudo da regulação genética. ATAC-seq permite o mapeamento de regiões de cromatina aberta, fornecendo insights sobre a acessibilidade do DNA e a localização de elementos regulatórios. Em contraste, RNA-seq quantifica os níveis de expressão gênica, iluminando a dinâmica do panorama transcricional. A integração desses dois conjuntos de dados capacita os pesquisadores a desvendar a interação entre a arquitetura da cromatina e a expressão gênica.

Integração de ATAC-seq e RNA-seq

ATAC-seq captura regiões de cromatina aberta utilizando uma enzima transposase para fragmentar o DNA acessível. Esta técnica identifica áreas onde fatores de transcrição e outras proteínas regulatórias se ligam, influenciando a expressão gênica. Ao analisar os dados de ATAC-seq, os pesquisadores podem identificar potenciadores, promotores e outros elementos cis-regulatórios que governam a ativação ou repressão gênica.

A integração de ATAC-seq e dados de RNA-seq fornece uma perspectiva holística sobre a regulação gênica. Permite que os pesquisadores conectem a acessibilidade da cromatina com a dinâmica da expressão gênica, descobrindo relações causais entre elementos regulatórios e seus genes-alvo. Esta integração ajuda a identificar potenciais fatores de transcrição que impulsionam padrões de expressão específicos ao modular a estrutura da cromatina. Além disso, permite a identificação de módulos gênicos co-regulados que desempenham papéis essenciais em processos celulares.

Estratégias Analíticas

A integração de dados de ATAC-seq e RNA-seq envolve uma análise em múltiplas etapas. Após o processamento individual dos dados, normalização e etapas de controle de qualidade, os conjuntos de dados são integrados por meio de correlações estatísticas ou abordagens de aprendizado de máquina. A análise de correlação identifica genes com mudanças concordantes na acessibilidade da cromatina e na expressão. A análise de expressão diferencial em ambos os conjuntos de dados pode revelar genes que estão passando por mudanças coordenadas, iluminando sua relevância funcional.

Estudos de Caso

Estudo de Caso 1: Regeneração do Trigo

• Contexto

A transformação genética é indispensável para investigar a função gênica e melhorar características das culturas. No entanto, esta técnica é menos eficiente no trigo. Para abordar esta limitação, é necessária uma compreensão holística da dinâmica transcricional e da cromatina durante a regeneração do trigo. A integração das técnicas ATAC-seq (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing) e RNA-seq (sequenciamento de RNA) oferece um meio poderoso para desvendar a rede regulatória gênica que orquestra a regeneração.

• Métodos

Técnicas de RNA-seq, ATAC-seq e CUT&Tag.

• Resultados

A análise multi-ômica integrada revelou que a expressão sequencial mediada por auxina de genes que governam a transição do destino celular está intimamente ligada a mudanças na acessibilidade da cromatina e modificações de histonas. A rede regulatória construída que impulsiona a regeneração do trigo foi dominada por 446 fatores de transcrição essenciais. A análise comparativa destacou padrões divergentes de ligação ao DNA dos fatores de transcrição DOF entre trigo e Arabidopsis. A validação experimental demonstrou que TaDOF5.6 e TaDOF3.4 poderiam aumentar a eficiência de transformação em distintas variedades de trigo, sublinhando seu papel potencial na melhoria da eficácia da transformação genética.

Regeneração e transformação do trigo. (Liu et al., 2023)

Estudo de Caso 2: Padrões de Expressão Gênica em Poliploides de Plantas

• Contexto

A adaptabilidade e plasticidade do trigo pão allohexaploide (Triticum aestivum. L., BBAADD) são consideradas influenciadas pela divergência de expressão devido à variação genética e interações entre seus subgenomas. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a essa divergência de expressão permanecem pouco claros. Os fatores de transcrição semelhantes à proteína de ligação ao promotor Squamosa (SPL) desempenham papéis fundamentais em vários processos biológicos. Para elucidar a rede regulatória que governa a expressão gênica no trigo e o papel dos SPLs nesse processo, este estudo integrou várias técnicas ômicas, incluindo DAP-seq para 40 SPLs, ATAC-seq e RNA-seq.

• Métodos

DAP-seq, ATAC-seq e RNA-seq

• Resultados

Alvo Diversificado de SPL: O estudo revelou que um conjunto de SBRs de baixa afinidade foi alvo de múltiplos SPLs, levando a preferências de sequência diferenciais em torno do motivo central GTAC.

Conservação de SBRs: Apesar de sua baixa afinidade, os SBRs identificados foram evolutivamente conservados e mostraram enriquecimento para sinais de GWAS relacionados a características agrícolas importantes.

Variações de CRE e Divergência de Subgenomas: A análise dos SBRs dentro das regiões cis-regulatórias (CREs) de genes sintênicos demonstrou alta diversificação entre os subgenomas. Apenas uma pequena fração de SBRs (menos de 8%) coexistiu em genes triádicos, enfatizando o papel crítico das variações de CRE na diferenciação de subgenomas.

Validação Funcional: Experimentos de knockout das subfamílias TaSPL7A/B/D e TaSPL15A/B/D forneceram evidências experimentais de que tanto SBRs de alta quanto de baixa afinidade desempenham papéis essenciais na regulação da expressão gênica para controlar o número de brotos e tamanhos de espigas.

Locais de ligação de SPL de baixa afinidade contribuem para a divergência de expressão do subgenoma em trigo allohexaploide. (Pei et al., 2023)

Estudo de Caso 3: Respostas das Plantas ao Estresse Térmico

Contexto:

A regulação intrincada da expressão gênica em plantas envolve interações complexas entre fatores de transcrição (TFs), estrutura da cromatina e a organização tridimensional do genoma dentro do núcleo. Esta organização proporciona às plantas a capacidade de responder rapidamente a estresses ambientais, alterando padrões de expressão gênica. No entanto, os mecanismos subjacentes às mudanças dinâmicas na conformação da cromatina e sua relação com a expressão gênica durante as respostas ao estresse permanecem pouco compreendidos. Este estudo de caso foca na investigação das mudanças cromatínicas em todo o genoma associadas ao reprogramação transcricional em resposta ao estresse térmico em plantas de tomate.

Métodos

Para elucidar a dinâmica da reorganização da cromatina e da expressão gênica sob condições de estresse térmico, os pesquisadores utilizaram uma combinação de duas técnicas poderosas: Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq) e sequenciamento de RNA (RNA-seq).

Resultados

Os dados mostraram que o estresse térmico induziu mudanças rápidas na arquitetura da cromatina das plantas de tomate. Essas mudanças envolveram a formação transitória de contatos entre promotores e potenciadores, sugerindo um papel para a conformação tridimensional da cromatina na mediação da expressão gênica responsiva ao estresse. Os genes diferencialmente expressos identificados através do RNA-seq indicaram que as mudanças cromatínicas observadas estavam associadas à expressão de genes responsivos ao estresse térmico. Isso sugeriu uma ligação direta entre a arquitetura da cromatina alterada e a ativação de genes específicos necessários para a adaptação ao estresse térmico.

Os pesquisadores exploraram ainda mais os mecanismos moleculares que impulsionam a reorganização da cromatina durante o estresse térmico. Eles descobriram que o fator de transcrição HSFA1a, conhecido por ser essencial para a tolerância ao estresse térmico em tomate, desempenhou um papel crucial na orquestração da reorganização espacial da cromatina. Isso indicou que os fatores de transcrição são jogadores-chave no controle das respostas transcricionais dinâmicas através da reconfiguração tridimensional dos contatos entre promotores e potenciadores.

HSFA1a modula as respostas das plantas ao estresse térmico e altera a organização tridimensional da cromatina das interações potenciador-promotor. (Huang et al., 2023)

Referências:

1. Liu, Xuemei, et al. "Desvendando a rede regulatória transcricional envolvida no aumento da regeneração e transformação do trigo." Nature Plants (2023): 1-18.
2. Pei, Hongcui, et al. "Locais de ligação de SPL de baixa afinidade contribuem para a divergência de expressão do subgenoma em trigo allohexaploide." Science China Life Sciences 66.4 (2023): 819-834.
3. Huang, Ying, et al. "HSFA1a modula as respostas das plantas ao estresse térmico e altera a organização tridimensional da cromatina das interações potenciador-promotor." Nature Communications 14.1 (2023): 469.