O que é Gene e Sequenciação de Genes?

O que é um Gene?

Um gene serve como uma unidade fundamental de informação genética codificada no DNA. Ele orquestra a expressão das características de um organismo, orientando a síntese de proteínas através dos intricados processos de transcrição e tradução. Em essência, os genes ditam a manifestação da composição genética de um indivíduo, exercendo uma influência profunda sobre as características exibidas por um organismo.

O que é Sequenciação Genética?

Sequenciação de genes revela o intrincado plano da vida codificado nos nossos genes. A composição genética de cada organismo, embora diversa, reflete, em última análise, uma disposição única das quatro bases fundamentais: adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C). Na sua essência, o sequenciamento genético é o meticuloso processo de desvendar esta sequência, iluminando a ordem precisa dessas bases dentro de um gene.

A técnica aproveita o poder de um sequenciador de genes, um instrumento sofisticado projetado para decifrar a informação genética incorporada no ADN. Utilizando uma abordagem subtil, o sequenciamento de genes emprega marcadores fluorescentes de cores distintas para distinguir entre as quatro bases. À medida que o gene passa pelo sequenciador, um sistema a laser ativa a emissão de luz fluorescente de cada base, revelando a sua disposição sequencial.

Estas luzes emitidas, cada uma correspondendo a uma base específica, são então capturadas por uma câmara especializada, transformando a sequência genética numa tapeçaria visual de cores vibrantes. Através de uma análise meticulosa destes sinais fluorescentes, a ordem precisa das bases dentro do gene é decifrada, oferecendo profundas percepções sobre os blocos fundamentais da vida.

Representação dos cromossomas da Arabidopsis. (Iniative et al., 2000)

Aplicações do Sequenciamento de Genes

A sequenciação genética tornou-se ubíqua, revolucionando a nossa abordagem à compreensão e gestão da informação genética. Esta tecnologia de ponta analisa e decifra a sequência completa de genes extraídos de amostras de sangue ou saliva, oferecendo informações inestimáveis sobre predisposição a doenças, traços comportamentais e cuidados médicos individualizados.

Com a capacidade de prever a probabilidade de várias doenças e discernir características comportamentais, o sequenciamento genético desempenha um papel fundamental na saúde preventiva. Ao identificar marcadores genéticos associados a condições específicas, permite medidas proativas para prevenir e tratar doenças antes que se manifestem.

Mais de 45 anos, sequenciação de genes passou por uma evolução notável, culminando na quarta geração de tecnologia de sequenciação. Os avanços nas técnicas de sequenciação, juntamente com a diminuição dos custos, democratizaram o acesso a esta ferramenta transformadora, integrando-a na vida quotidiana.

As aplicações do sequenciamento genético abrangem uma vasta gama de áreas, incluindo tanto a investigação como os domínios clínicos. Desde estudos multi-ómicos e sequenciamento de coortes populacionais até ao desenvolvimento de medicamentos, agricultura e gestão da saúde pública, o seu impacto é abrangente. Na medicina clínica, o sequenciamento genético facilita testes pré-natais não invasivos, auxilia em tecnologias reprodutivas, ajuda no diagnóstico de tumores e no tratamento de precisão, e permite a deteção precoce de doenças infeciosas.

Hoje, o sequenciamento genético transcende as fronteiras médicas tradicionais, encontrando utilidade na investigação científica, serviços ao consumidor e além. A sua versatilidade sublinha o seu papel fundamental na formação do futuro dos cuidados de saúde e para além disso.

A História do Sequenciamento de Genes

A história do sequenciamento genético abrange 45 anos, marcada por quatro gerações de inovação tecnológica que impulsionaram o crescimento exponencial da indústria.

Em 1977, Sanger pioneirou a primeira geração de sequenciamento de genes, lançando as bases para os avanços subsequentes. Um momento crucial chegou em 1998 com o advento da tecnologia de sequenciamento capilar, que acelerou as velocidades de sequenciamento em dez vezes e catalisou o cronograma ambicioso do Projeto Genoma Humano.

A viragem do milénio deu início à segunda geração de sequenciadores de alto rendimento em 2005, reduzindo os custos de forma impressionante em 100 vezes e desencadeando uma tendência que superou até mesmo a Lei de Moore, apropriadamente chamada de "super Lei de Moore." Esta era assistiu a melhorias sem precedentes na velocidade, comprimento e rendimento do sequenciamento.

Hoje, sequenciação de próxima geração (NGS) é o auge da viabilidade comercial e da adoção generalizada. O NGS revolucionou o sequenciamento ao introduzir a terminação reversível de nucleotídeos não ligados, permitindo a síntese e o sequenciamento simultâneos com um rendimento, precisão e acessibilidade sem precedentes. Embora inovações como o sequenciamento PacBio SMRT e as tecnologias de nanopore prometam uma maior precisão e versatilidade, os desafios práticos de custo e precisão persistem, garantindo a dominância de NGS no futuro previsível.

No entanto, a trajetória do sequenciamento genético continua a evoluir, impulsionada pela busca por maior rendimento, comprimentos de leitura mais longos, maior precisão, tempos de resposta mais rápidos, tolerância a falhas aprimorada, aplicabilidade mais ampla e custos reduzidos. À medida que a tecnologia avança, o panorama do sequenciamento genético detém um potencial ilimitado para avanços transformadores que moldarão o futuro dos cuidados de saúde e da descoberta científica.

Tecnologia de Sequenciação de Sanger

A sequenciação de Sanger, aclamada como o padrão-ouro para a deteção e validação de mutações, surgiu em 1977 como a força pioneira na análise genética.

Isto Sequenciação de Sanger o método utiliza eletroforese para separar fragmentos de ADN de diferentes comprimentos, permitindo um sequenciamento preciso. Encontra o seu nicho em cenários que requerem um diagnóstico genético meticuloso, como linhas familiares com genes causadores claramente definidos, pequenos grupos amostrais e loci genéticos conhecidos.

O método Sanger (de terminação de cadeia) para sequenciação de DNA

As forças de Sequenciação de Sanger reside na sua capacidade de gerar leituras longas, que se estendem até 1000 pares de bases, aliadas a uma precisão sem igual, estabelecendo o padrão para a deteção e validação de mutações. A utilização da amplificação por PCR, um procedimento laboratorial rotineiro, aumenta a sua praticidade. No entanto, existem limitações, incluindo baixo rendimento, custos de sequenciação proibitivos, procedimentos operacionais complexos e automação limitada, tornando-o inadequado para empreendimentos de sequenciação genética em larga escala.

Além disso, a sua incapacidade de detectar grandes deleções, disparidades no número de cópias de genes e certos tipos de mutações sublinha a necessidade de sequências de referência, complicando ainda mais a sua utilidade.

Tecnologia de Sequenciação NGS

Sequenciação de próxima geração destaca-se como a metodologia de sequenciação mais comercialmente madura e amplamente adotada. Dentro deste âmbito, emergem cinco categorias distintas: sequenciação por pirofosfato, sequenciação sintética, sequenciação por ligadura, sequenciação por semicondutor e DNB.

NGS, ou sequenciação de alto rendimento de nova geração, baseia-se na fundação da sequenciação por terminação sintética, dependendo da amplificação por PCR de modelos de DNA ligados a superfícies sólidas para síntese e sequenciação. Esta tecnologia encontra ampla aplicação na identificação de genes candidatos associados a doenças, abrangendo desde distúrbios monogénicos até condições complexas como diabetes, obesidade e até mesmo câncer.

Enquanto sequenciação de nova geração possui um rendimento, precisão e acessibilidade notáveis, mas os seus curtos comprimentos de leitura apresentam desafios, podendo levar à perda de informações de sequências menos abundantes durante o sequenciamento. Além disso, exceto para DNB, a dependência da PCR pode introduzir erros sistemáticos, exigindo sequenciamento repetido para mitigar discrepâncias.

A tecnologia DNB contorna estas questões ao minimizar o viés da PCR, aumentando assim a precisão do sequenciamento. Consequentemente, o sequenciamento de alto rendimento emerge como uma tecnologia fundamental, impulsionando a adoção generalizada e a comercialização do sequenciamento de genes.

Sequenciação de Longa Leitura

Sequenciação por leitura de tempo de molécula únicarepresenta uma mudança de paradigma, utilizando métodos físicos para decifrar informações genéticas ao nível de moléculas individuais. Evoluindo a partir do NGS, esta tecnologia aborda as limitações fundamentais de comprimento de leitura e viés de PCR inerentes ao seu predecessor.

Como um avanço inovador no sequenciamento do genoma, Sequenciação de tempo de leitura de molécula única PacBio oferece capacidades sem precedentes para analisar material genético tanto a nível de célula única como a nível de molécula única.

A tecnologia de sequenciação de leitura longa estende os comprimentos das leituras de sequência além dos alcançados pelos seus predecessores, permitindo a deteção direta de sequências de RNA e de metilação sem a necessidade de amplificação por PCR. Ao contornar a PCR, reduz o risco de introduzir mutações artificiais.

No entanto, enquanto Sequenciação SMRT da PacBio destaca-se em muitas áreas, mas fica aquém em aplicações de deteção de um único gene, particularmente para distúrbios monogénicos. A sua principal desvantagem reside na sua menor precisão de sequenciação, necessitando de múltiplas repetições ou correção através de algoritmos probabilísticos para melhorar a fiabilidade.

Esta necessidade de sequenciação repetitiva ou correção algorítmica eleva significativamente o custo e diminui a eficiência da sequenciação, apresentando desafios para a adoção e implementação generalizadas.

Tecnologias de Nanopore de Oxford (ONT)tem sido pioneira em avanços inovadores na tecnologia de sequenciação, revolucionando tanto os parâmetros de custo como de velocidade, enquanto continua a reduzir o tamanho dos instrumentos. Central à inovação da ONT está o nanoporo, um pequeno orifício imobilizado numa membrana resistiva, com uma proteína motorizada que facilita o seu movimento através de um campo elétrico transmembranar.

Dentro deste sistema, uma única cadeia de ADN é puxada através do nanoporo por uma proteína motorizada, impulsionada do pólo negativo para o pólo positivo sob a influência do campo elétrico transmembranar. Devido ao diminuto tamanho do nanoporo, apenas uma única base pode atravessá-lo, cada base induzindo uma interrupção única na corrente elétrica, que é posteriormente detetada e registada.

Sequenciação por nanoporo possui várias vantagens, incluindo comprimentos de leitura alargados, custo-efetividade, velocidades de sequenciação rápidas e uma eficiência notável. Facilita a sequenciação dinâmica em tempo real e suporta a sequenciação direta de DNA e RNA nativos, alcançando precisões de deteção que variam entre 92% e 98%.

No entanto, apesar destas forças, a sequenciação por nanoporo não atinge a precisão alcançada pelos métodos de sequenciação de nova geração, com taxas de precisão que normalmente variam entre 92% e 98%. Ao contrário da sequenciação PacBio SMRT, que utiliza sequenciação de repetição para aumentar a precisão, a sequenciação por nanoporo depende de métodos de sequenciação por hidrólise, o que contribui para tempos de sequenciação mais longos e limita as capacidades de melhoria da precisão.

Assim, enquanto Sequenciação por nanoporo oferece vantagens notáveis, incluindo a sua versatilidade e capacidades em tempo real, mas a sua menor precisão de sequenciamento e os mecanismos limitados de melhoria da precisão representam desafios para o ajuste fino dos parâmetros de sequenciamento, como tempo e custo.

Referência:

1. Iniciativa, Genoma de Arabidopsis. "Análise da sequência do genoma da planta com flores Arabidopsis thaliana." Natureza 408.6814 (2000): 796-815.