Question 1

Qual é a sua estratégia de construção e sequenciação de bibliotecas para sequenciação do transcriptoma de LncRNA?

Accepted Answer

Extrair o RNA total da amostra, remover o RNA ribossómico e construir uma biblioteca específica de cadeia, ou seja, biblioteca de lncRNA. Com base na plataforma Illumina NoveSeq 6000, é realizada a sequenciação de dupla extremidade PE250. Sequenciação: Uma vez que a biblioteca de lncRNA contém informações de mRNA e lncRNA, e a abundância de lncRNA é baixa, o volume de dados recomendado é de 10-12G de dados brutos/amostra para mamíferos como humanos, ratos e camundongos.

Question 2

Por que o rRNA deve ser removido durante a sequenciação e construção da biblioteca de lncRNA?

Accepted Answer

Apenas a extremidade 3' do lncRNA possui estrutura de poliA, outros lncRNAs não têm estrutura de poliA, portanto, a enriquecimento com esferas magnéticas oligo(dT) não é recomendado para obter informações mais completas sobre lncRNA.

Question 3

Quais são os requisitos de espécies para sequenciação de lncRNA?

Accepted Answer

A espécie possui um genoma de referência, spliced pelo menos até o nível do andaime. 
Uma anotação mais completa está disponível.

Question 4

Como prever genes-alvo de lncRNA?

Accepted Answer

O lncRNA pode regular genes-alvo por co-localização e co-expressão como um RNA regulador. A previsão de genes-alvo por co-localização baseia-se no princípio de que a função do lncRNA está relacionada aos genes codificadores de proteínas próximos às suas coordenadas, de modo que os genes codificadores de proteínas na posição próxima do lncRNA são selecionados como seus genes-alvo. O princípio da previsão de genes-alvo por co-expressão sugere que a função do lncRNA não está relacionada à localização do gene codificador, mas ao seu gene codificador de proteínas co-expressado. Os genes-alvo podem ser previstos por análise de correlação ou análise de co-expressão entre a expressão de lncRNAs e genes codificadores de proteínas entre amostras.

Question 5

Como explicar que as sequências parciais de lncRNA previstas são consistentes com sequências de mRNA?

Accepted Answer

O lncRNA de sentido não foi removido do banco de dados, o lncRNA do tipo sentido sobrepõe-se em certa medida ao mRNA. 
Se as posições de lncRNA e mRNA forem exatamente as mesmas, precisamos considerar se estão localizadas nas cadeias positiva e negativa, respetivamente. LncRNA e mRNA podem existir em cadeias diferentes, mas as bases são completamente complementares.

Question 6

Como filtrar lncRNA ao analisar dados de sequenciação?

Accepted Answer

1. Mesclar transcritos obtidos pela splicing de todas as amostras usando o software cuffcompare e selecionar transcritos que são identificados por ambos os softwares de splicing, ou que aparecem em pelo menos duas amostras ao mesmo tempo. 
2. Selecionar transcritos ≥ 200bp. 
3. Filtrar transcritos pelos seus valores de FPKM. 
4. Se existirem dados conhecidos de lncRNA para a espécie, os transcritos obtidos na etapa anterior são primeiramente comparados com os lncRNAs conhecidos pelo cuffcompare para obter transcritos que são idênticos aos lncRNAs conhecidos. Esta fração de transcritos foi diretamente incorporada ao conjunto final de lncRNA sem filtragem adicional. Depois disso, aqueles transcritos que são semelhantes ou idênticos aos transcritos conhecidos acima são filtrados comparando-os com transcritos de tipos conhecidos não-lncRNA e não-mRNA (rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA, pre-miRNA, pseudogenes, etc.) da espécie. Se não houver dados conhecidos de lncRNA disponíveis, então é realizada uma comparação direta com transcritos de tipos conhecidos não-lncRNA e não-mRNA da espécie. 
5. Filtrar candidatos a lincRNA, lncRNA intrónicos, lncRNA anti-sentido e outros tipos para análise quantitativa subsequente comparando com mRNA conhecido e usando as informações nos resultados da análise cuffcompare.

Question 7

Que experimentos de validação podem ser realizados após a sequenciação de lncRNA?

Accepted Answer

Verificação de expressão: verificar o nível de expressão de genes diferenciais por quantificação fluorescente, se é consistente com os resultados da sequenciação. 
Hibridização in situ (FISH) 
Experimento de perda de função: silenciar lncRNA usando siRNA, shRNA, ácido nucleico anti-sentido e outros métodos para observar o efeito da intervenção sobre o valor acrescentado celular, apoptose, invasão, metástase, cromossomos, etc., e verificar a expressão de genes-alvo de lncRNA. 
Experimento de aquisição funcional: construir vetor de superexpressão de lncRNA, observar o efeito sobre a proliferação celular, apoptose, invasão, etc. após a superexpressão de lncRNA, e verificar a abundância de expressão dos genes-alvo de lncRNA. 
Experimentos de superexpressão ou silenciamento: se o lncRNA estiver localizado no núcleo e o nível de expressão dos genes-alvo previstos for encontrado elevado após a deleção, especula-se que o lncRNA pode se ligar a fatores de transcrição (proteínas) para inibir a transcrição do DNA; ou se o lncRNA estiver localizado no citoplasma e experimentos de superexpressão ou deleção encontrarem que algumas atividades proteicas estão elevadas ou reduzidas, especula-se que o lncRNA pode se ligar a algumas proteínas. Os lncRNAs podem se ligar a algumas proteínas e exercer seus efeitos.

Perguntas e Respostas sobre Sequenciação de LncRNA

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