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Perguntas e Respostas sobre Sequenciação de RNA Pequeno

  • Questões Gerais

  • A sequenciação de pequenos RNAs pode ser feita mesmo que não haja um genoma de referência para a espécie?
    • A sequenciação de pequenos RNAs pode ser realizada para espécies sem um genoma de referência, mas é necessário fazer primeiro o splicing dos transcritos sem um transcriptoma de referência e usar os transcritos como sequências de referência para a análise de sequenciação de pequenos RNAs.
  • Para espécies sem genoma de referência, como realizar sequenciação de pequenos RNAs para a previsão de genes-alvo?
    • Sugerimos que faças. sequenciação do transcriptoma para descobrir transcrições em grande escala, construir uma biblioteca Unigene da espécie-alvo. Em seguida, com base nisso, é realizada a sequenciação de pequenos RNAs para obter pequenos RNAs conhecidos e novos miARNs previstos através da anotação, e a previsão de genes-alvo é realizada comparando com os genes na biblioteca Unigene, e finalmente, a anotação funcional dos genes-alvo é concluída.
  • Como realizar o controlo de qualidade das bibliotecas de sequenciação de pequenos RNAs?
    • O método de construção de bibliotecas para sequenciação de pequenos RNAs utilizando o Illumina Hiseq2000 é o seguinte:
      Purificação de gel PAGE de moléculas de RNA pequeno de tamanho específico.
      Ligação e purificação de emenda 5' (2).
      Purificação de ligação de emenda 3'.
      Amplificação por RT-PCR.
      (5) Purificação da biblioteca de RNA pequeno.
  • Posso usar os resultados da sequenciação de pequenos RNAs para analisar tRNA?
    • Não, não podes. O RNA transportador (tRNA) é um RNA não codificante universalmente expresso com um comprimento de 70-90 nucleotídeos (nt). O tRNA possui uma estrutura terciária estável e um elevado grau de modificação de bases, metilação, reações de translocação dentro dos nucleósidos e reações de redução (necessárias para a função do tRNA).
  • Posso usar RNA total para preparar uma biblioteca de RNA pequeno? Ou tenho que isolar ou enriquecer RNA pequeno como amostra inicial?
    • As bibliotecas de pequenos RNAs podem ser preparadas utilizando RNA total. Não é necessário enriquecer pequenos RNAs se a concentração de pequenos RNAs for superior a 0,5%, e recomenda-se utilizar RNA total com um valor de RIN superior a 7. Você pode contacte-nos para mais informações sobre o nosso serviço de sequenciação de tRNA.
  • Posso usar RNA pequeno enriquecido para preparar uma biblioteca de RNA pequeno?
    • Sim, pode usar RNA pequeno enriquecido, e se a quantidade de RNA pequeno enriquecido estiver próxima de 10 ng, dilua a junção na taxa de diluição recomendada de 100 ng de RNA total, conforme descrito nas instruções. Se a quantidade de RNA pequeno enriquecido estiver próxima de 100 ng, dilua a junção na taxa de diluição recomendada de 1 µg de RNA total, conforme descrito nas instruções.
  • Como realizar a validação experimental após a sequenciação de sRNA?
    • Existem vários métodos para a validação experimental subsequente de sRNA.
      1. qPCR, que verifica a expressão de microRNA.
      2. O RIP-seq, que enriquece RNA com modificação de metilação ou RNA que se liga especificamente à proteína alvo através da tecnologia RIP. A sequenciação de alto rendimento do RNA enriquecido é realizada e comparada com o genoma para obter informações sobre a localização de microRNAs que se ligam especificamente à proteína alvo, etc.
      Sistema de reportagem de luciferase.
      4. Construção de vetores de superexpressão ou silenciamento de genes-alvo.
  • Quais são as características do nosso serviço de sequenciação de RNA pequeno?
    • (1) Pequenas moléculas de RNA podem ser estudadas diretamente ao nível dos nucleótidos, sem os problemas de reatividade cruzada e ruído de fundo causados pelos sinais de imitação fluorescente da hibridação de microarrays tradicional, facilitando a diferenciação de diferentes moléculas de RNA pequeno da mesma família, bem como sequências semelhantes.
      (2) Permite a análise de alta capacidade de espécies sem a necessidade de informações de sequência prévias, bem como informações sobre a estrutura secundária.
      (3) Alta sensibilidade e alta capacidade de sequenciação proporcionam profundidade de dados e cobertura para a descoberta e estudo de moléculas de RNA pequeno e permitem a deteção de transcritos raros com baixa abundância.
      (4) Os dados brutos gerados pela sequenciação são compatíveis com uma variedade de software de análise, permitindo a anotação da informação genómica de Pequenos RNAs e a análise dos seus níveis de expressão, a capacidade de anotar Pequenos RNAs conhecidos utilizando a base de dados de Pequenos RNAs, e a capacidade de analisar dados não correspondentes para descobrir novas espécies e isoformas de Pequenos RNAs e encontrar informação para estudos mais aprofundados.
  • Como realizar a análise de sinal bruto de sequenciação de sRNA
    • (1) Controlo de qualidade dos dados: A qualidade dos dados de sequenciação é um pré-requisito importante para a fiabilidade dos resultados da análise de informações. Os dados brutos de sRNA precisam de passar por processos de controlo de qualidade, como sequências de junção, remoção de sequências de bases contendo N, remoção de sequências de bases de baixa qualidade, triagem de comprimento, etc., para obter dados de sequenciação de alta qualidade e contar o número de espécies de pequenos RNAs e a distribuição de comprimento.
      (2) Alinhamento do genoma de referência: A partir das leituras limpas de cada amostra após a triagem de comprimento, as leituras são alinhadas ao genoma de referência e os resultados do alinhamento são contabilizados.
      (3) Análise de miRNA conhecido: as leituras são comparadas com a base de dados de miRNA para identificar micro RNAs conhecidos.
      (4) Análise de RNA não codificante: comparar leituras com sequências de ncRNA de espécies ou com a base de dados Rfam para identificar rRNA, tRNA, snRNA, snoRNA.
      (5) Predição de novos miRNA: realizar a predição de novos miRNA utilizando o miREvo e realizar análises como preferência de bases e estrutura secundária.
      (6) Expressão génica e análise diferencial: quantificar miARNs conhecidos e novos miARNs com base nos resultados da comparação, e realizar uma análise diferencial de miARNs para obter miARNs expressos diferencialmente entre amostras ou subgrupos.
      (7) Previsão de genes-alvo de miRNA: realizar a previsão diferencial de genes-alvo de miRNA utilizando os softwares miRanda e RNAhybrid.
      (8) Enriquecimento funcional: Com base nos genes-alvo de miARNs diferenciais entre amostras ou subgrupos, obtemos informações funcionais significativamente enriquecidas através de bases de dados de anotação funcional, como GO, KEGG, etc.
  • Se não houver sequência do genoma, como encontrar os miARNs relevantes e os seus genes-alvo?
    • A primeira forma é referir-se à literatura existente, por exemplo, miR156 e miR172 têm um papel no crescimento nutricional para o crescimento reprodutivo. Se o sequenciamento do genoma não for possível, então deve-se realizar o sequenciamento do transcriptoma e o sequenciamento de pequenos RNAs para analisar o transcriptoma como referência. Finalmente, as sequências podem ser submetidas diretamente a alguns softwares online, como o psRNATarget, para previsão de locais-alvo.
  • Ao realizar o sequenciamento de sRNA, que informações relevantes devo fornecer além da amostra?
    • É necessária a informação sobre o genoma da respetiva espécie e sobre os exões, intrões e repetições relevantes. Se o genoma da espécie não estiver disponível, é necessária informação sobre espécies estreitamente relacionadas.
  • Qual é o comprimento de leitura/tag para sequenciação de RNA pequeno usando o Illumina Hiseq2000? Qual é a profundidade de cobertura recomendada?
    • Para sequenciação de Small RNA, os clientes podem escolher o comprimento do Small RNA que lhes interessa, que varia entre 18-30 nt. Para o Illumina Hiseq2000, recomendamos um comprimento de sequenciação de 35 bp, após o qual a informação da sequência é cortada para remover a sequência de emenda e deixar apenas a sequência de Small RNA. Para estudos de descoberta e análise de Small RNA, não recomendamos a DepthofCoverage durante a sequenciação devido à necessidade de realizar a análise de expressão de Small RNA. Geralmente, são adquiridos pelo menos 5 milhões de leituras por amostra, o que é informação suficiente para garantir uma sequenciação precisa.
  • Quais fatores afetam o sequenciamento de pequenos RNAs?
    • Os fatores que influenciam o sequenciamento de sRNA são principalmente os seguintes:
      (1) A qualidade da amostra fornecida pelo cliente. No processo de sequenciação de RNA pequeno, o sRNA precisa ser isolado, e a qualidade e pureza do RNA pequeno isolado afetam diretamente os resultados da sequenciação. Uma vez que o RNA é facilmente degradado, as operações de extração e purificação de RNA devem ser realizadas estritamente de acordo com os requisitos experimentais para garantir a qualidade das amostras.
      (2) Qualidade da construção da biblioteca: A construção da biblioteca requer gel PAGE para separar e purificar o RNA pequeno, e depois conectar a junção para purificação antes da RT-PCR. Neste processo, é necessária uma operação cuidadosa para garantir que o RNA pequeno não seja degradado, e o processo de purificação deve garantir que a junção seja removida de forma limpa, pois a junção residual terá um impacto na sequenciação subsequente.
      (3) Controlo do volume de carga da biblioteca de sequenciação: Este fator também afeta bastante a densidade da geração de clusters. Uma vez que o volume de carga é muito pequeno, apenas 1-8 pg, a capacidade de quantificar com precisão microsamples torna-se também um fator importante que afeta o rendimento da sequenciação.

  • Preparação de Amostras

  • Que tipos de amostras podem ser processadas pelo nosso serviço de sequenciação de sRNA?
  • Quais são os requisitos de amostra para sequenciação de pequenos RNAs?
    • (1) Requisito de pureza da amostra: o valor OD deve estar entre 1,8 e 2,2; a relação 28S:18S deve ser pelo menos 1,5 para a deteção por eletroforese.
      (2) Concentração da amostra: a concentração total de RNA não deve ser inferior a 200 ng/μL, por favor, não utilize o método de extração por coluna para extrair RNA total, a amostra total não deve ser inferior a 20 μg (RNA pequeno: RNA total > 0,3%). Ou forneça amostras de RNA pequeno com concentração superior a 20 ng/μL e quantidade total superior a 1 μg.
      (3) Amostras de RNA pequeno devem ser armazenadas a -20°C; por favor, forneça a concentração específica, volume, tempo de preparação, nome do solvente e origem da espécie das amostras de RNA pequeno. Inclua também dados de controlo de qualidade, incluindo gráfico de gel de eletroforese, dados de deteção espectrofotométrica ou de instrumento Nanodrop. Se forem necessárias múltiplas preparações de amostras, por favor, forneça as amostras necessárias para múltiplas preparações de amostras.
      (4) Transporte de amostras: As amostras devem ser transportadas em tubos de 1,5 ml com o nome da amostra, concentração e tempo de preparação indicados no tubo e selados com Parafilm. Recomenda-se o uso de gelo seco para o envio e a utilização de um método de envio mais rápido para reduzir a possibilidade de degradação da amostra durante o transporte.
  • Quais são os requisitos especiais para a extração de amostras para sequenciação de pequenos RNAs?
    • Recomenda-se não utilizar kits de sobre-coluna da Qiagen e de outras empresas ou a precipitação com LiCl para evitar a perda de pequenos fragmentos de RNA. Se amostras de RNA pequeno forem fornecidas diretamente, podem ser utilizados kits especiais para a extração de RNA pequeno.
  • Por que existem sequências de rRNA degradadas nos resultados?
    • Uma vez que o RNA total está frequentemente ligeiramente degradado e existe um processo natural de degradação nos organismos, os dados conterão uma pequena percentagem de fragmentos de mRNA degradados. No entanto, esta percentagem é geralmente muito baixa e depende da qualidade da amostra de RNA total.
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