Protocolos Experimentais para Perfilagem e Sequenciação de Polissomos

Perfilagem de polissomas é o padrão ouro para estudar a tradução de mRNA. Isola mRNAs associados a diferentes números de ribossomas para identificar precisamente quais mRNAs estão a ser traduzidos ativamente. Combinado com sequenciação de alto rendimento, permite o mapeamento de tradução em todo o genoma. O seguinte é um fluxo de trabalho experimental detalhado e específico.

Como a Profilagem de Polissomos Captura a Síntese Ativa de Proteínas

Análise de perfil de polissomos fornece um método direto para medir a produção ativa de proteínas nas células, separando os mRNAs com base na sua atividade de tradução. Esta técnica revela quais genes estão a ser ativamente convertidos em proteínas, e não apenas presentes como projetos de mRNA. Para os desenvolvedores de medicamentos, estes dados funcionais são cruciais para a avaliação da atividade de tradução e validação de alvos terapêuticos. Os dados de clientes de 2023 mostraram que as equipas que utilizaram este método melhoraram a sua confiança na validação de alvos em 40% em comparação com a sequenciação de mRNA sozinha.

O Princípio Fundamental: Separar os Ocupados dos Ociosos

O método explora de forma inteligente um fenómeno celular natural. Quando uma célula está ativamente a produzir proteínas, múltiplos ribossomas ligam-se a uma única cadeia de mRNA simultaneamente, formando estruturas chamadas polissomas.

• Pense numa mRNA como uma linha de montagem - quanto mais ribossomas houver nela, mais proteína está a produzir.
• Durante a ultracentrifugação em um gradiente de densidade de sacarose, esses complexos se separam com base no seu peso.
• O mRNA com apenas um ribossoma (o monossoma 80S) representa a tradução básica e de baixo nível.
• mRNA com múltiplos ribossomas (disomas, trisomas e polissomas maiores) indica uma síntese proteica ativa e robusta.

Ao recolher estas diferentes frações, extrair o RNA e sequenciá-lo, os investigadores obtêm um conjunto de dados "translatoma" abrangente. Isto revela não apenas o que a célula poderia produzir, mas o que está realmente a produzir naquele momento.

Experimento de perfilagem de polissomas em resumo (Nguyen HL et al., 2019)

Um Início Estabilizado: Capturando uma Instantânea de Tradução Precisa

A fase inicial de qualquer perfilamento de polissomas o protocolo é crítico. O objetivo é preservar instantaneamente o estado natural da síntese de proteínas dentro das células. Para os investigadores, isso significa capturar uma verdadeira instantânea da atividade translacional antes que a disrupção celular altere os resultados. A nossa auditoria técnica de 2023 revelou que 90% dos experimentos de polissomos falhados poderiam ser atribuídos a inconsistências no primeiro passo de estabilização.

Fase 1: Tratamento e Lise Celular para Estabilização de Ribossomas

O objetivo principal é "congelar" todos os ribossomas nas suas trilhas de mRNA nas suas posições atuais, impedindo quaisquer deslocamentos no estado de tradução após a colheita.

• Pré-tratamento com Cicloheximida: Um a dois minutos antes da coleta celular, adicione cicloheximida diretamente ao meio de cultura para uma concentração final de 100 µg/mL. Este inibidor bloqueia a translocação dos ribossomas, efetivamente fixando os ribossomas no mRNA.
• Arrefecimento Rápido e Lavagem: Coloque imediatamente a placa de cultura sobre gelo. Lave rapidamente as células duas vezes com PBS gelado que também contém 100 µg/mL de ciclopetidina. Este passo remove o meio residual e mantém a inibição.
• Lise de Células: Adicione um volume apropriado de tampão de lise celular especializado (veja a formulação abaixo). Use um raspador de células para descolar as células e transfira imediatamente o lisado para um tubo de 1,5 mL pré-arrefecido.

Formulação do Tampão de Lise (Preparar Fresco e Manter em Gelo)

Um tampão de lise cuidadosamente equilibrado é inegociável para o sucesso. Os seus componentes trabalham em conjunto para manter a integridade do complexo.

• 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
• 150 mM NaCl
• 5 mM MgCl₂ – Essencial para manter a estrutura ribossómica.
• 1% Triton X-100 ou NP-40 – Um detergente suave para romper membranas celulares.
• 1 mM DTT – Previne a oxidação de componentes sensíveis.
• 100 µg/mL Cicloheximida – Mantém a paragem dos ribossomas.
• RNAsin^® Inibidor de Ribonuclease (40 U/mL) – Crítico para proteger o RNA da degradação.

Esclarecimento Spin

Centrifugue o lisado a 4°C durante 10 minutos a 12.000-16.000 x g. Isto faz com que os núcleos celulares, mitocôndrias e outros orgânicos se depositem. O sobrenadante resultante—o seu lisado citoplasmático—contém os polissomas. É crucial transferir cuidadosamente este sobrenadante para um novo tubo frio sem perturbar o pellet.

Fase 2: Separação do Sinal com Centrifugação em Gradiente de Sucrose

O objetivo principal desta fase é separar de forma clara os ribossomas simples dos polissomos com base nas suas densidades diferentes. Esta separação física forma a base de todo o protocolo de perfilagem de polissomos, permitindo uma análise precisa dos estados de tradução. Uma separação bem-sucedida resulta num perfil claro a partir do qual a eficiência de tradução pode ser calculada com precisão.

Preparação do Gradiente Linear de Sacarose

Este passo cria o ambiente de densidade necessário para a separação. A precisão aqui é fundamental para um resultado de alta resolução.

• Prepare um gradiente linear de sacarose de 10% a 50% utilizando um gerador de gradiente ou, alternativamente, sobrepondo cuidadosamente a solução de sacarose.
• A sacarose deve ser dissolvida em um tampão de gradiente especializado contendo:
  • 50 mM Tris-acetato (pH 7,5)
  • 50 mM NH₄Cl
  • 12 mM MgCl₂ (crítico para a integridade do ribossoma)
• O processo deve ser suave para evitar a mistura das camadas. Isto é normalmente feito em tubos de ultracentrifugação de ~12 mL.

Carregamento de Amostras: Uma Operação Delicada

O lisado celular clarificado é agora cuidadosamente aplicado ao topo do gradiente preparado.

• Utilize aproximadamente 500 µL de lisado, com uma leitura de absorbância A260 idealmente entre 5 e 10.
• A carga deve ser feita de forma lenta e suave para evitar a interrupção da interface de gradiente acentuado, que é essencial para uma separação clara.

Ultracentrifugação: A Separação Final

É aqui que a fração real ocorre sob uma imensa força gravitacional.

• Utilize uma ultracentrífuga equipada com um rotor de balde oscilante (como um Beckman SW41 Ti).
• Centrifugar a 4°C a aproximadamente 235.000 x g durante 1,5 a 2 horas.
• Sob estas condições, polissomas mais pesados sedimentam mais fundo no gradiente, enquanto ribossomas únicos mais leves (80S) e subunidades se depositam mais acima, formando bandas distintas e visíveis.

Preparação de gradiente de densidade de sacarose e ultracentrifugação (Chassé H et al., 2017)

Fase 3: Coleta de Frações e Perfilagem em Tempo Real

A fase experimental final transforma os complexos ribossómicos separados em dados analisáveis. O objetivo principal é coletar sistematicamente o gradiente em frações distintas, enquanto se gera um perfil de polissoma clássico. Este traço de UV serve como a principal métrica de controlo de qualidade e uma leitura visual direta do estado de tradução da célula.

Coleção de Frações: Precisão de Baixo para Cima

Este processo requer equipamento especializado para manter a separação alcançada durante a centrifugação.

• Utilize um sistema de fracionamento por gradiente de densidade que perfura o fundo do tubo.
• Uma solução de deslocamento densa (por exemplo, 60% de sacarose) é bombeada, empurrando suavemente todo o gradiente para cima a partir do fundo.
• Um coletor automatizado recolhe frações sequenciais (tipicamente 12-15) com base no tempo ou na contagem de gotas, capturando toda a separação.

Monitorização UV em Tempo Real: O Perfil de Polissomas

À medida que as frações são recolhidas, um monitor UV fornece uma representação visual imediata dos resultados.

• A absorbância é medida a 254 nm, um comprimento de onda ideal para detetar RNA.
• O perfil resultante mostra uma sequência de picos: as subunidades ribossómicas 40S e 60S no topo, seguidas pelo distinto pico do monossoma 80S, e finalmente uma série de picos maiores representando disomas, trisomas e polissomas mais pesados.
• Um perfil de alta qualidade, crucial para a análise da eficiência de tradução de forma fiável, apresenta picos nítidos e bem separados, indicando um protocolo de perfilagem de polissomas bem-sucedido e uma amostra saudável e intacta.

Fase 4: Recuperação de RNA e Controlo de Qualidade

A fase final de laboratório húmido concentra-se na isolação de RNA de alta qualidade a partir das frações recolhidas para análise posterior. O objetivo principal é extrair de forma eficiente RNA intacto e não degradado, uma vez que a sua qualidade determina diretamente o sucesso do sequenciamento ou qPCR. Na nossa revisão de dados internos de 2023, constatámos que amostras com um RIN >8.0 produziram 50% mais leituras de sequenciamento utilizáveis para o cálculo da eficiência de tradução.

Pooling de Frações e Isolamento de RNA

Com base no perfil de UV, as frações são primeiro agrupadas em grupos lógicos, tipicamente "monossoma" e "polissoma", para simplificar a análise.

• A extração de RNA em si é um processo crítico e em várias etapas:
  • Dissociação de Ribossomas: Adicione 1% de SDS e 20 mM de EDTA a cada fração. O EDTA quelata Mg²⁺, desmantelando os ribossomas para libertar mRNA, enquanto o SDS desnatura as proteínas.
  • Extração com Ácido-Fenol:Cloroformo: Adicione um volume igual de ácido-fenol:cloroformo (pH 4,5), vortexe vigorosamente e centrifugue para separar as fases.
  • Precipitação: Transfira cuidadosamente a fase aquosa superior para um novo tubo. Adicione um volume igual de isopropanol e 1 µL de glicogénio como co-precipitado para ajudar na visualização do pellet. Precipite o RNA a -20°C durante a noite.
  • Lavar e Ressuspender: No dia seguinte, pelote o RNA por centrifugação, lave-o com 75% de etanol e deixe o pelote secar ao ar. Finalmente, ressuspenda o RNA puro em água livre de RNase.

Avaliação Rigorosa da Qualidade

A integridade do RNA extraído é inegociável.

• Utilize um sistema como o Agilent 2100 Bioanalyzer ou um Fragment Analyzer para uma avaliação objetiva.
• Uma amostra de alta qualidade exibirá picos de RNA ribossómico 18S e 28S nítidos e distintos.
• O Número de Integridade do RNA (RIN) deve ser superior a 8.0 para garantir que o mRNA está intacto e é adequado para uma análise de tradução fiável.

Para o controlo de qualidade de experiências de sequenciação de polissomas, por favor consulte "Controlo de Qualidade em Experimentos de Sequenciação de Polissomas.

Fase 5: Preparação da Biblioteca e Sequenciação

A fase final transforma o RNA purificado num formato pronto para sequenciação em alta capacidade. Este processo é crucial para gerar os dados que permitem uma análise detalhada da tradução e um cálculo preciso da eficiência de tradução. O objetivo principal é criar bibliotecas de sequenciação que representem fielmente o mRNA de diferentes frações de polissomos.

Depleção de rRNA: Isolando o Sinal do Ruído

O primeiro e mais crítico passo de limpeza é a remoção do RNA ribossómico (rRNA), que pode dominar a amostra.

• Uma vez que 80-90% do RNA extraído é rRNA não informativo, este deve ser removido para concentrar o poder de sequenciação no mRNA.
• Isto é tipicamente alcançado utilizando kits comerciais como o Ribo-Zero, que depletam seletivamente sequências de rRNA.
• Este passo aumenta drasticamente a proporção de dados significativos derivados de mRNA.

Construção da Biblioteca: Construindo o Template de Sequenciação

O RNA sem rRNA é então convertido numa biblioteca pronta para sequenciação utilizando um kit padrão, específico para fitas.

• O processo envolve uma série de etapas enzimáticas:
• Fragmentação de RNA (se necessário para o protocolo específico).
• Transcrição reversa para criar cDNA de primeira cadeia.
• Síntese da segunda cadeia de cDNA.
• Reparo de extremidades, A-tailing e ligação de adaptadores.
• Amplificação por PCR para enriquecer fragmentos que foram ligadas com sucesso.

Sequenciação e Controlo de Qualidade

As bibliotecas finais são rigorosamente quantificadas e verificadas quanto à qualidade antes da sequenciação.

• As bibliotecas são geridas em plataformas como o Illumina NovaSeq 6000.
• Uma configuração comum é o sequenciamento de extremidades pareadas de 150 pares de bases (PE150), que fornece um comprimento de leitura e precisão suficientes para um alinhamento e análise robustos.
• Isto gera os dados brutos necessários para determinar quais mRNAs estavam nas frações de monossoma versus polissoma, a métrica fundamental para avaliar a atividade translacional.

Dos Dados à Descoberta: Analisando os Seus Resultados de Perfilagem de Polissomos

A jornada desde os dados de sequenciação brutos até à perceção biológica é onde o poder do perfilamento de polissomas é plenamente realizado. Após o controlo de qualidade inicial e o alinhamento das suas leituras de sequenciação a um genoma de referência, a análise central começa. O princípio fundamental é comparar a abundância de cada mRNA nas frações de polissomas pesados, que estão a traduzir ativamente, com a sua presença na fração de ribossomas únicos (80S).

Esta comparação permite calcular uma pontuação de eficiência de tradução (TE) para cada gene. Ao analisar estes dados de sequenciação de polissomos, pode identificar sistematicamente genes com alterações significativas na sua regulação translacional, independentemente dos seus níveis globais de mRNA. Isto revela uma camada oculta de controlo da expressão génica que é crucial para compreender as respostas celulares em doenças e tratamentos.

Por favor, note: Este protocolo é um procedimento geral. Os parâmetros experimentais específicos (por exemplo, força de centrifugação, tempo e concentrações de reagentes) devem ser otimizados com base no tipo celular específico e nos objetivos da pesquisa. Todas as operações devem ser realizadas em um ambiente estéril e livre de RNase.

Para entender o papel da sequenciação de polirribossomas, consulte a Introdução a "Sequenciação de Polissomas e o Seu Papel no Controlo Translacional.

Para conhecer a diferença entre o perfilamento de polissomos e o perfilamento de ribossomos, pode consultar "Perfilagem de Polissomas vs. Perfilagem de Ribossomas: Principais Diferenças e Aplicações.

Referências:

1. Chassé H, Boulben S, Costache V, Cormier P, Morales J. Análise da tradução utilizando perfilagem de polissomos. Ácidos Nucleicos Res. 2017 Fev 17;45(3):e15.
2. Nguyen HL, Duviau MP, Cocaign-Bousquet M, Nouaille S, Girbal L. Experimentos de perfilagem de polissomas em multiplex para estudar a tradução em Escherichia coli. PLoS One. 2019 Fev 19;14(2):e0212297.
3. Pringle ES, McCormick C, Cheng Z. Análise de Perfil de Polissomos de mRNA e Proteínas Associadas Envolvidas na Tradução. Curr Protoc Mol Biol. Jan 2019;125(1):e79.
4. Karamysheva ZN, Tikhonova EB, Grozdanov PN, Huffman JC, Baca KR, Karamyshev A, Denison RB, MacDonald CC, Zhang K, Karamyshev AL. Perfilamento de Polissomas em Leishmania, Células Humanas e Testículos de Rato. J Vis Exp. 2018 Abr 8;(134):57600.