Visão Geral das Variações no Número de Cópias (CNVs)

O que é Variação no Número de Cópias (CNV)?

As Variações no Número de Cópias (CNVs) abrangem alterações no número de segmentos específicos de DNA dentro de genomas individuais. Estas variações constituem um tipo de variação estrutural genómica, envolvendo tipicamente segmentos que excedem 1 quilobase de comprimento. Estas distinções estruturais podem surgir através de processos como duplicação, deleção ou outras modificações e frequentemente afetam um ou mais genes.

Os CNVs representam uma classe de variantes estruturais genómicas, que são ainda categorizadas em dois níveis: microscópico e submicroscópico. A variação estrutural genómica microscópica diz respeito principalmente a anomalias cromossómicas visíveis quando observadas ao microscópio, abrangendo condições como aneuploidia, deleções, inserções, inversões, translocações e várias outras alterações estruturais. A variação estrutural genómica submicroscópica, por outro lado, refere-se a variações nos comprimentos de fragmentos de DNA que variam de 1 quilobase a 3 megabases, abrangendo deleções, inserções, duplicações, rearranjos e inversões. Coletivamente, essas alterações submicroscópicas são referidas como CNVs ou CNPs (Polimorfismos de Número de Cópia, CNP).

Variações no número de cópias da linha germinativa. (Nakatochi et al., 2021)

Mecanismos Subjacentes à Formação de Variações no Número de Cópias (VNCs)

Variações no Número de Cópias (VNCs) são fenómenos genéticos que surgem de uma variedade diversificada de eventos genéticos. Estes mecanismos abrangem vários processos distintos. Um desses mecanismos é o erro de replicação, onde erros durante a replicação do DNA resultam em inserções ou deleções, levando, em última análise, a alterações no número de cópias de segmentos específicos de DNA. Outro mecanismo envolve a recombinação não homóloga, caracterizada pela troca de segmentos de DNA entre diferentes cromossomos, resultando em alterações no número de cópias para ambos os cromossomos envolvidos.

Os eventos de recombinação ocorrem principalmente dentro de regiões específicas de sequências repetitivas conhecidas como Repetições de Baixa Cópia (LCRs). As LCRs abrigam vários elementos genéticos, incluindo genes, pseudogenes, fragmentos de genes, sequências retrovirais e regiões reguladoras de genes. Tipicamente, as LCRs estão situadas nos terminais dos cromossomas e ao longo dos filamentos cromossómicos. O tamanho, a orientação relativa das LCRs, o espaçamento entre cópias e o grau de homologia de sequência influenciam todos a formação de CNVs.

No entanto, os mecanismos precisos que governam a formação de CNV permanecem incompletamente compreendidos. Vários mecanismos foram propostos:

• Recombinação Homóloga Não Alelica (NAHR): A NAHR ocorre principalmente em regiões propensas a recombinações frequentes. As principais características das regiões de NAHR incluem tamanhos de fragmentos superiores a 10 kb, homologia de sequência superior a 97%, orientação de sequência bem definida e LCRs localizados dentro do mesmo cromossoma.
• União de Extremidades Não Homólogas (NHEJ): Algumas CNVs mais simples podem surgir através do mecanismo NHEJ, que não requer homologia precisa entre quebras de DNA. Em vez disso, o NHEJ pode unir quebras de DNA díspares, potencialmente levando a rearranjos cromossómicos como translocações e outras mutações.
• Paragem de Garfo e Mudança de Modelo (FoSTeS/MMBIR): FoSTeS representa um mecanismo complexo responsável pela geração de CNVs com estruturas intrincadas. Este mecanismo não só produz CNVs que abrangem vários megabases, mas também induz rearranjos a nível de genes e exões. Estes rearranjos incluem duplicações de genes e embaralhamento de exões, contribuindo significativamente para a evolução do genoma.

A interação destes mecanismos e as suas consequências específicas em vários contextos justificam uma investigação mais aprofundada. Uma compreensão abrangente da formação de CNV e das suas implicações para a diversidade genética e a etiologia das doenças exige investigação contínua.

CNVs e Doença

Atualmente, Variações no Número de Cópias (VNCs) no âmbito das doenças pode ser amplamente classificado em três categorias principais:

• CNVs Herdados de Células Germinativas: Estes CNVs são inerentes ao genoma parental e são transmitidos à sua prole através das células germinativas. A deteção destes CNVs envolve a análise dos genomas dos pais e é um aspecto crucial do aconselhamento genético. Os CNVs herdados de células germinativas estão associados ao desenvolvimento de numerosos distúrbios genéticos.
• CNVs Adquiridos de Novo: Ao contrário dos CNVs herdados das células germinativas, estas variantes não estão presentes nos genomas parentais, mas surgem nos genomas dos recém-nascidos. Podem resultar de eventos mutacionais súbitos ou mutações que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário inicial. Os CNVs adquiridos de novo também estão associados ao aparecimento de várias doenças.
• CNVs Produzidos por Células Somáticas: Estes CNVs surgem após a fase de célula única embrionária e podem resultar de influências ambientais, divisão celular ou outros processos biológicos. Os CNVs somáticos podem diferir entre vários tecidos dentro de um indivíduo e podem influenciar a funcionalidade e as características das células somáticas.

Impacto das Variações no Número de Cópias (CNVs) na Atividade Gênica

Variações no Número de Cópias (VNCs) dispersos por vários loci no genoma podem dar origem a uma diversidade de variações fenotípicas genómicas e moleculares, contribuindo, em última análise, para o surgimento de doenças complexas, incluindo o câncer. Os mecanismos subjacentes através dos quais as CNVs influenciam a expressão génica e, consequentemente, desencadeiam a tumorigenese incluem o seguinte:

• Knockouts e Disrupções de Genes: A forma mais direta como as CNVs influenciam a expressão génica é eliminando um gene inteiro ou perturbando porções específicas do mesmo. Isso pode ocorrer através da inserção de sequências parciais que codificam proteínas não funcionais ou funcionalmente alteradas.
• Interferência em Regiões Regulatórias: As CNVs podem também exercer a sua influência ao interferir nas regiões regulatórias de um gene. Deleções fragmentárias dentro destas regiões regulatórias podem aumentar a atividade de transcrição do gene, enquanto duplicações fragmentárias envolvendo promotores e áreas adjacentes podem resultar em rearranjos instáveis, diminuindo, em última análise, a atividade de expressão do gene. Um exemplo notável disto é a modulação relacionada a CNV do gene UGT2B17 no câncer testicular, que não só impacta a sua própria atividade, mas também influencia genes vizinhos.
• Efeitos Dependentes da Dose: Os CNVs têm o potencial de modular diretamente a expressão de genes específicos através dos seus efeitos de dose. Pequenas deleções ou duplicações de genes dentro das regiões de CNV podem perturbar o seu funcionamento normal. Em essência, um aumento no número de cópias de CNV amplifica a expressão gênica na região afetada ou em regiões adjacentes, enquanto uma redução no número de cópias diminui a expressão gênica.
• Alterações de Genes Estruturais: As CNVs podem induzir alterações estruturais nos genes, afetando assim os produtos da expressão genética. Por exemplo, uma CNV prevalente no cromossoma 1q21.1, que também está implicada na suscetibilidade ao neuroblastoma, resulta em uma expressão modificada de um transcrito do gene da família de pontos de quebra do neuroblastoma recentemente identificado (NBPF), o NBPF23.

Métodos para Detetar Variações no Número de Cópias (CNVs)

Hibridização Genómica Comparativa Baseada em Array (aCGH)

Hibridização Genómica Comparativa Baseada em Array, comumente referido como aCGH, é uma técnica poderosa utilizada para identificar variações no número de cópias dentro de um genoma. Ao co-hibridar amostras rotuladas com marcadores fluorescentes distintos em um único chip de microarray, a aCGH permite a visualização de deleções ou ampliações no DNA genómico, tanto no contexto de tumores como de doenças hereditárias em grupos cromossómicos inteiros. Este método utiliza instrumentos e chips especializados, com alta resolução e um elevado grau de automação. Importante, a aCGH possibilita a deteção abrangente de CNVs em todo o genoma numa única experiência.

Uma comparação dos passos conceptuais nos métodos aCGH e CNV-seq. (Xie et al., 2009)

Array de Polimorfismo de Nucleotídeo Único (Array SNP)

O Array de Polimorfismo de Nucleotídeo Único, ou Array SNP, emprega uma abordagem única distinta da aCGH. Em vez de uma estratégia de duas hibridações, o SNP Array envolve um único evento de hibridação entre as amostras em investigação e as sondas do microarray. Em seguida, determina o número de cópias em cada locus genómico ao analisar as intensidades de sinal de várias amostras. O SNP Array oferece uma resolução excecional e é capaz de detectar uma ampla gama de microdeleções e microduplicaçãos, incluindo fenómenos como a disomia uniparental (UPD), a deleção heterozigótica (LOH) e o quimerismo, além de CNVs.

Métodos Baseados em Sequenciamento

Técnicas baseadas em sequenciação fornecer uma abordagem alternativa para a deteção de CNV, tipicamente utilizando sequenciação do genoma completoSemelhante ao aCGH, estes métodos envolvem a sequenciação de quantidades iguais de DNA da amostra de interesse e de um DNA de controlo normal, que são então comparados a uma sequência de referência. O número de cópias em cada locus genómico é determinado comparando as contagens de leituras dentro de janelas deslizantes entre as duas amostras. Esta abordagem permite a deteção de grandes segmentos de CNVs em todo o genoma.

Referências:

1. Nakatochi, Masahiro, Itaru Kushima e Norio Ozaki. "Implicações das variações no número de cópias da linha germinativa em transtornos psiquiátricos: revisão de estudos genéticos em larga escala." Revista de Genética Humana 66.1 (2021): 25-37.
2. Xie, Chao, e Martti T. Tammi. "CNV-seq, um novo método para detectar variação no número de cópias usando sequenciação de alto débito." BMC bioinformática 10 (2009): 1-9.