Diretrizes para Submissão de Amostras
Análise de Segregação em Lote Perguntas e Respostas
Questões Gerais
- Como funciona o seu serviço de análise BSA?
- Em BSA (análise de segregantes agrupados)Os indivíduos numa população segregante são agrupados e misturados de acordo com o fenótipo do traço alvo, e os indivíduos ou linhagens na população são divididos em dois grupos com base nas diferenças relativas do traço alvo. Em seguida, o DNA dos indivíduos ou linhagens nos dois grupos é misturado separadamente para formar um pool de mistura de DNA relativo. Os pools parentais e de descendentes são sequenciados, SNPs são detectados e os valores de índice dos pools de descendentes são calculados com base nos loci com diferenças puras entre os pais, sendo selecionados os loci com diferenças maiores.
- Que tipo de pais são adequados para a construção populacional?
- Recomenda-se selecionar progenitores com diferenças de traços únicos e poucos loci heterozigóticos tanto quanto possível, e também se recomenda que as diferenças entre os progenitores não sejam demasiado grandes, porque se as diferenças parentais forem demasiado grandes, isso levará a muitos falsos positivos e será fácil localizar a região de falso positivo; se selecionar duas variedades que estão diretamente relacionadas, é fácil localizar a região candidata porque as diferenças parentais são demasiado pequenas; para os progenitores do traço alvo, existem várias maneiras de obter os progenitores. Para os progenitores do traço alvo, existem vários métodos para obter os genes candidatos, como mutagénese por EMS, indivíduos naturais, mutagénese por UV, todos os quais podem ser usados para localizar os genes candidatos por. BSA.
- Como escolher uma população para BSA?
- De acordo com o processo de formação populacional, os tipos de população são geralmente divididos em populações naturais e populações familiares. BSA A localização de traços é aplicada para localizar o efeito principal de um único traço numa população familiar.
A origem dos pais é importante e existem vários métodos para obter pais para os traços-alvo, como mutagénese por EMS, indivíduos naturais, mutagénese por UV, inserção de T-DNA, etc.
- De acordo com o processo de formação populacional, os tipos de população são geralmente divididos em populações naturais e populações familiares. BSA A localização de traços é aplicada para localizar o efeito principal de um único traço numa população familiar.
- Como construir uma população familiar para o BSA?
- Existem muitas maneiras de construir a população familiar, entre as quais F2, BC e RIL são as populações comuns que podem ser usadas para BSA. A geração F1 convencional não pode ser usada para a localização de traços BSA porque não há segregação de traços. DH também pode ser usado para a localização de traços BSA, mas não é comum devido à dificuldade de construção.
- É possível testar apenas os progenitores? Ou apenas o pool de descendentes? Ou apenas 1 pool de descendentes?
- (1) Se o traço em estudo for um traço de mutação induzido por EMS, apenas duas pools subgeracionais (tipo selvagem + mutante) podem ser testadas, ou um progenitor (tipo selvagem) e uma pool subgeracional (mutante) podem ser testados;
(2) Se o traço em estudo for um traço quantitativo, recomenda-se medir dois progenitores e dois pools subgeracionais. O efeito do número de amostras nos resultados da análise foi avaliado pelo projeto online real, no qual os melhores resultados foram obtidos com quatro amostras (ou seja, dois progenitores + dois pools subgeracionais), seguidos de um progenitor e dois pools subgeracionais, e se apenas dois pools subgeracionais forem medidos, o número de falsos positivos aumentaria e muitos SNPs seriam obtidos.
- (1) Se o traço em estudo for um traço de mutação induzido por EMS, apenas duas pools subgeracionais (tipo selvagem + mutante) podem ser testadas, ou um progenitor (tipo selvagem) e uma pool subgeracional (mutante) podem ser testados;
- Pode o ADN ser sequenciado a partir de amostras de sementes dos progenitores, e pode o ADN ser sequenciado a partir de folhas da progénie?
- Se o DNA de diferentes partes do material afeta o Sequenciação de ADN baseia-se principalmente em dois fatores: primeiro, a composição da pele da semente e do endosperma, a pele da semente geralmente vem da mãe, se a pele da semente for afetada principalmente; segundo, o grau de pureza, se o grau de pureza for elevado, os progenitores e os descendentes não são muito diferentes, portanto, o efeito não é significativo.
- Como misturar pools de DNA de descendentes?
- Recomenda-se extrair DNA de cada amostra de descendência separadamente e depois misturar quantidades iguais, o que pode reduzir o ruído de fundo e evitar erros sistemáticos.
- É possível garantir o tamanho da região candidata e o número de genes candidatos a serem localizados?
- O tamanho da região candidata e o número de genes candidatos estão relacionados ao tamanho da população, às diferenças no material parental, às características dos traços-alvo, à profundidade de sequenciação, ao nível genómico das espécies analisadas e a muitos outros fatores, que podem ser estimados através da experiência do projeto ou da literatura publicada.
- O intervalo de localização é grande, como ajustá-lo?
- Pode ajustar o intervalo de confiança ou selecionar marcadores SNP e InDel no intervalo de localização BSA e realizar mapeamento local para reduzir efetivamente o intervalo de localização.
- Como validar os genes-alvo após a triagem de genes candidatos?
- (1) Validação de SNPs. (A) Converter os SNPs candidatos em marcadores CAPS ou dCAPS, ou seja, realizar uma análise do local de reconhecimento da endonuclease de restrição nos SNPs candidatos, eliminar os SNPs que causam alterações nos locais de reconhecimento enzimático, amplificar os fragmentos onde estes SNPs estão localizados utilizando os primers correspondentes, e depois realizar digestão enzimática e eletroforese nos produtos amplificados para converter os SNPs em marcadores CAPS; realizar análise de polimorfismo nos marcadores CAPS para verificar a disponibilidade dos marcadores; (B) Os SNPs candidatos foram amplificados por PCR, e depois os produtos de amplificação foram verificados por sequenciação Sanger;
(2) Validação da expressão de genes candidatos entre fenótipos utilizando RT-PCR
(3) Análise de expressão diferencial baseada em transcriptoma para ver se existem diferenças significativas na expressão génica
(4) Análise de RNAi: utilizando a tecnologia de RNAi para desativar ou desligar especificamente a expressão de genes específicos.
- (1) Validação de SNPs. (A) Converter os SNPs candidatos em marcadores CAPS ou dCAPS, ou seja, realizar uma análise do local de reconhecimento da endonuclease de restrição nos SNPs candidatos, eliminar os SNPs que causam alterações nos locais de reconhecimento enzimático, amplificar os fragmentos onde estes SNPs estão localizados utilizando os primers correspondentes, e depois realizar digestão enzimática e eletroforese nos produtos amplificados para converter os SNPs em marcadores CAPS; realizar análise de polimorfismo nos marcadores CAPS para verificar a disponibilidade dos marcadores; (B) Os SNPs candidatos foram amplificados por PCR, e depois os produtos de amplificação foram verificados por sequenciação Sanger;
- Qual poderá ser a razão para o efeito de posicionamento insatisfatório?
- Existem muitos fatores que levam a uma localização insatisfatória, principalmente os seguintes:
(1) grandes diferenças no background genético entre os pais, existem muitas outras diferenças além da característica alvo, o que cria muita interferência na análise e torna difícil a localização;
(2) estatísticas de traços complexos, o traço alvo pode ser composto por vários traços simples, que podem ser divididos e re-localizados, e também os traços quantitativos em si são difíceis de localizar e têm alguma incontrolabilidade;
(3) os dados de sequenciação estão contaminados, e os resultados da comparação podem ser verificados extraindo parte dos dados de sequenciação para fazer uma comparação blast na biblioteca nr;
(4) o método de análise não é aplicável, podemos usar o método ED e o método SNP-index para localização, respetivamente, e comparar os resultados de localização.
- Existem muitos fatores que levam a uma localização insatisfatória, principalmente os seguintes:
Preparação de Amostras
- Quais são os requisitos para os pais ao receberem o material?
- Os pais devem ser indivíduos o mais puros possível, o que pode ser alcançado através do cruzamento entre si. Os dois pais devem ter diferenças significativas nas características alvo, mas outras características devem ser consistentes tanto quanto possível para reduzir a interferência na análise de locos posterior.
- Quais são os requisitos para a população de descendentes?
- Teoricamente, desde que a progénie de cruzamentos entre progenitores com diferentes características alvo produza segregação de características, pode ser utilizada para BSA, mas as populações mais comumente usadas são: F2, populações de retrocruzamento, linhas recombinantes de auto-incompatibilidade, etc.
Para características de qualidade, a proporção de indivíduos dominantes para recessivos na descendência pode ser 1:1, 3:1, etc. Para características quantitativas, os traços da descendência devem conformar-se a uma distribuição normal.
- Teoricamente, desde que a progénie de cruzamentos entre progenitores com diferentes características alvo produza segregação de características, pode ser utilizada para BSA, mas as populações mais comumente usadas são: F2, populações de retrocruzamento, linhas recombinantes de auto-incompatibilidade, etc.
- É possível fazer BSA sem os pais?
- Sim, mas não é recomendado. Neste momento, os algoritmos de localização mais utilizados são o método ED e o método snp-index, dos quais o método ED pode ser realizado sem os pais, mas o efeito de tal localização definitivamente não é tão bom quanto o experimento com dados de dois pais. Recomenda-se re-hibridizar para construir a população e guardar o DNA parental para uso posterior.
- Quanto de amostra é suficiente para a prole?
- A amostragem da progénie deve conformar-se aos seguintes princípios: para localizar características qualitativas, devem ser selecionados o maior número possível de indivíduos recessivos, com um mínimo de 20, geralmente entre 30-50, e então o número correspondente de indivíduos dominantes; para localizar características quantitativas, geralmente são selecionados os 5%-10% mais extremos de indivíduos para cada característica, e um histograma semelhante ao seguinte também pode ser feito com os dados das características da progénie:
- A população de descendentes não é grande o suficiente, devo dar prioridade a tomar os extremos ou ao número?
- É difícil ter mais de 200 indivíduos na população de muitas espécies, haverá menos de 20 indivíduos extremos, por isso sugerimos que se tomem menos amostras do que selecionar amostras com características intermédias, o que apenas interferirá na análise posterior. Claro que há um certo risco de que o experimento com apenas dez ou mais amostras por grupo não produza resultados satisfatórios.
- Deve a extração do ADN da filha ser misturada primeiro e depois extraída, ou extraída primeiro e depois misturada?
- O estado ideal é extrair DNA de cada amostra filha individualmente e, em seguida, misturá-las de forma igual e uniforme em um único DNA de acordo com a concentração de DNA, de modo que a quantidade de informação de DNA de cada filha seja igual. No entanto, devido ao atual baixo preço de transação dos projetos de sequenciação, a prática geral das empresas é permitir que os clientes retirem quantidades iguais de mistura de tecido de cada amostra e, em seguida, extraiam como uma amostra de DNA em pool misto.
Misturar e extrair amostras de tecido iguais não é tão eficaz quanto misturar após a extração de uma única amostra, mas o seu impacto é perfeitamente aceitável. Embora misturar primeiro e depois extrair resulte em quantidades desiguais de DNA de cada amostra, se a amostragem for suficientemente ideal, os genótipos dessas amostras nos loci-alvo devem ser consistentes, e o principal impacto é a composição do ruído de fundo, que não afeta a nossa capacidade de encontrar os loci-alvo mais tarde na análise de dados.
- O estado ideal é extrair DNA de cada amostra filha individualmente e, em seguida, misturá-las de forma igual e uniforme em um único DNA de acordo com a concentração de DNA, de modo que a quantidade de informação de DNA de cada filha seja igual. No entanto, devido ao atual baixo preço de transação dos projetos de sequenciação, a prática geral das empresas é permitir que os clientes retirem quantidades iguais de mistura de tecido de cada amostra e, em seguida, extraiam como uma amostra de DNA em pool misto.
- Qual é o requisito de qualidade do DNA para re-sequenciação?
- Embora os requisitos específicos de cada empresa sejam ligeiramente diferentes, a qualidade do DNA necessária para o re-sequenciamento não é muito exigente. O que precisa de fazer é correr o gel de agarose, observar se a banda principal está clara e livre de contaminação por proteínas, e também verificar a concentração e a quantidade total com um espectrofotómetro (recomenda-se que a concentração não seja inferior a 20ng/ml e a quantidade total não seja inferior a 2 microgramas).
- Qual é o requisito de profundidade para os pais e descendentes ao realizar o re-sequenciamento?
- Para garantir a precisão dos marcadores SNP e InDel, o sequenciamento deve assegurar uma certa profundidade, sendo recomendado que os progenitores não tenham menos de 20×, e o pool misto deve ser combinado com o número de amostras para determinar que a média de cada amostra não seja inferior a 1×. Por exemplo, se a prole é de 30, adicionando 30, então a profundidade de sequenciamento de cada pool misto da prole não pode ser inferior a 30×; se o financiamento permitir, pode então ser aprofundado de forma apropriada.
Apenas para fins de investigação, não se destina a diagnóstico clínico, tratamento ou avaliações de saúde individuais.
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