Question 1

Como posso construir uma biblioteca de amplicões?

Accepted Answer

Sequenciação de amplicões é um método de construção de biblioteca que utiliza principalmente métodos de PCR para amplificar fragmentos moleculares específicos e introduz regiões de junção e primers de sequenciação durante o processo de amplificação.

Question 2

Qual é o seu processo de construção de biblioteca de amplicões?

Accepted Answer

Atualmente, existem 2 opções principais de processo. A construção de biblioteca em uma etapa significa que a amplificação e a ligadura são realizadas simultaneamente através de uma ronda de reações de PCR. A construção de biblioteca em duas etapas envolve duas rondas de reações de PCR com amplificação e ligadura separadas.

Question 3

Quais são os principais problemas que podem ser resolvidos pela sequenciação de amplicões?

Accepted Answer

Atualmente, é a mais amplamente utilizada no campo da microbiologia, sendo usada para detectar a composição da comunidade microbiana. Inclui principalmente sequenciação de 16S rDNA, sequenciação de 18S rDNA, sequenciação de ITS e sequenciação de amplicões de região alvo. As sequências de uma região altamente variável de 16S/18S/ITS determinadas pela plataforma de sequenciação de alto rendimento de segunda geração são usadas para responder às diferenças entre espécies na taxonomia de bactérias, fungos e arqueias em amostras ambientais, o que é um guia importante para estudar a composição microbiana em ambientes marinhos, de solo e de fezes intestinais.

Question 4

A sequenciação de amplicões pode obter todas as sequências do genoma?

Accepted Answer

A sequenciação de amplicões só pode detectar um ou alguns fragmentos de genes específicos em uma amostra, mas não todos os genes. O processo de construção da biblioteca passa por enriquecimento e triagem por PCR, que amplifica os fragmentos de interesse para o pesquisador dezenas de milhares e centenas de milhares de vezes.

Question 5

Quais são os fatores que afetam a construção da biblioteca de amplicões?

Accepted Answer

O processo de construção da biblioteca de amplicões é afetado por muitos fatores, como método de amplificação, enzima e número de ciclos de amplificação. Quanto maior a concentração inicial da amostra, maior o número de ciclos, e mais os resultados se desviam da situação real.

Question 6

A sequenciação de amplicões pode ser usada para análise da composição de espécies?

Accepted Answer

Existem várias formas de resultados de sequenciação de amplicões que podem ser usadas para mostrar a composição de comunidades bacterianas em uma amostra. Diagramas de Venn, mapas de componentes da estrutura da comunidade, mapas de cluster, mapas de Heatmap, árvores filogenéticas, etc. são todos bons para mostrar a composição das espécies.

Question 7

Em que áreas a sequenciação de amplicões pode ser aplicada?

Accepted Answer

A sequenciação de amplicões é um tipo de sequenciação de captura de região alvo (outra técnica de captura de região alvo é a captura por sonda de hibridação). A sequenciação de amplicões é a sequenciação de um fragmento de produto de PCR de comprimento específico para analisar a variação na sequência. A sequenciação de amplicões é capaz de sequenciar regiões alvo com alta cobertura e também detectar mutações de baixa frequência, dependendo das diferentes necessidades. Os tipos atuais de sequenciação de amplicões incluem sequenciação de genes funcionais, sequenciação de fragmentos de captura de sequência alvo e sequenciação de fragmentos metilados.

Question 8

Qual é o nosso serviço de análise de dados de sequenciação de amplicões?

Accepted Answer

QC, design experimental, fusão de sequências de extremidade dupla 
Extração de código de barras, QC e divisão de amostras, excisão de primers de amplificação 
Conversão de formato, remoção de redundâncias, clustering 
Remoção de quimeras, sequências não bacterianas, geração de sequências representativas e tabelas de OTU 
Anotação de espécies, manipulação de tabelas de OTU 
Árvore evolutiva, diversidade Alpha e Beta 
Estatísticas de classificação de espécies, filtragem de árvores evolutivas e outros

Question 9

Preciso padronizar o material inicial para a minha sequenciação de amplicões?

Accepted Answer

Nós ajustaremos a concentração das suas amostras para se adequar ao seu projeto. No entanto, você precisará seguir nossas Diretrizes de Submissão de Amostras ou entrar em contato connosco antes da submissão.

Question 10

Por que tenho altas concentrações de DNA antes de submeter e baixas concentrações depois de enviar para a empresa para teste?

Accepted Answer

O NanoDrop não consegue distinguir entre dsDNA e ssDNA (oligonucleotídeos e dNTP), o que pode fazer com que você superestime a quantidade de dsDNA na sua amostra. Na nossa empresa, combinamos Qubit, Nanodrop e eletroforese em gel para testar a qualidade das amostras de DNA.

Question 11

Como posso purificar amplicões?

Accepted Answer

As amostras purificadas podem ser purificadas por esferas/colunas de ligação de DNA, limpeza enzimática e purificação em gel.

Question 12

Quais são as diretrizes de submissão de amostras para sequenciação de amplicões?

Accepted Answer

Para sequenciação de amplicões Tipo de amostra: Amplicão Purificado Quantidade recomendada: ≥ 1 µg Quantidade mínima: 500 ng Concentração mínima: 20 ng/µL Para Sequenciação de 16S/18S/ITS Tipo de amostra: DNA Genómico Quantidade recomendada: ≥ 100 ng Quantidade mínima: 500 ng Concentração mínima: 1 g/µL Consulte nossas Diretrizes de Submissão de Amostras para mais detalhes.

Perguntas e Respostas sobre Sequenciação de Amplicons

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